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旋毛虫病是一种宿主广泛的人兽共患寄生虫病,对人类健康和畜牧业生产造成严重威害。尤其近年来随着人们饮食习惯的改变,因食生或半生动物肉类(如猪肉、羊肉、狗肉、野猪肉、熊肉等)而引起本病的暴发逐渐增多。由于旋毛虫病临床表现复杂多样,诊断比较困难,给及时的药物治疗造成了一定难度。因此,旋毛虫病的免疫预防显得至关重要。
表位疫苗因其安全无毒、引发的免疫应答针对性强、并摆脱了抑制性和毒性表位的影响而成为疫苗研制的发展方向之一,在寄生虫疫苗研究领域受到了广泛的关注。由于旋毛虫多虫期的共同寄生,使得与宿主免疫系统相互作用的抗原分子复杂多样,不同虫期保护性抗原成分不同,导致单一抗原分子很难针对体内不同虫期产生有效的免疫力,针对这种情况可选取不同虫期的抗原表位用于旋毛虫疫苗的构建。其中,获得保护性抗原表位是研制表位疫苗的必备前提。本研究的目的是筛选和鉴定基于旋毛虫副肌球蛋白的保护性抗原表位,为构建有效的抗旋毛虫病多表位疫苗奠定基础。
副肌球蛋白(paramyosin,Pmy)是多种无脊椎动物肌肉组织的主要结构蛋白,同时也是免疫调节分子,在寄生虫与宿主的相互作用中发挥重要的作用。在本课题组的前期研究中,我们应用人工免疫兔血清筛选了旋毛虫(Trichinellaspiralis,T.spiralis)成虫cDNA表达文库,克隆了旋毛虫副肌球蛋白(T.spiralisparamyosin,Ts-Pmy)基因。Ts-Pmy重组蛋白(rTs-Pmy)免疫小鼠产生Th2型为主的免疫应答并对抗旋毛虫的感染产生有效的免疫保护作用。本实验中,我们用具免疫保护性的抗Ts-Pmy单克隆抗体筛选了噬菌体随机十二肽库,同时结合运用B细胞网上预测工具及截短蛋白表位定位的方法,获得Ts-Pmy的B细胞线性表位和模拟表位,并研究其免疫学活性及诱导产生的免疫保护性。
本实验过程分为以下几部分:首先,利用杂交瘤技术制备分泌抗Ts-Pmy的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。以重组副肌球蛋白N端片段(recombinantN-terminus paramyosin of T.spiralis,rTs-Pmy-N)抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,获得了五株稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株,其中三株分泌IgG,两株分泌IgM抗体。杂交瘤7E2株可稳定的分泌IgG1亚类κ型抗体,连续传代20次和反复冻存均不影响抗体效价。Western blot结果显示mAb7E2能特异性的识别旋毛虫的虫体和重组副肌球蛋白。
其次,为获得具免疫保护作用的B细胞抗原表位,进行了mAb7E2被动免疫实验。经尾静脉注射mAb7E2的小鼠具有抗旋毛虫感染的免疫保护性,以400条肌幼虫攻虫,与PBS对照组相比获得了44.1％的减虫率(p<0.01)。mAb7E2的制备为Ts-Pmy抗原表位的获取和定位提供了工具。
再次,为获得Ts-Pmy的保护性抗原表位,我们利用mAb7E2筛选噬菌体十二肽库。经鉴定获得10个阳性噬菌体克隆。将阳性克隆测序并与Ts-Pmy蛋白进行同源性比较,它们主要与Ts-Pmy蛋白的第88-107和108-127位氨基酸具有较好的同源性。mAb7E2与Ts-Pmy截短蛋白的识别实验进一步确定Ts-Pmy蛋白第88-107位是与mAb7E2特异性识别的表位区,其序列为EEAEGTTDAQIDANRKRESE,命名为YX1。YX1可对重组或虫体副肌球蛋白与mAb7E2的结合产生竞争抑制作用。筛选获得的上述10个阳性噬菌体克隆共得到8种展示肽序列,经鉴定为Ts-Pmy的模拟表位。选取其中的2个核心克隆做进一步研究,其序列为W2:KLSDSALDTMWR,W8:AMTDPKLDHMRH。
最后,将上述鉴定出的三个表位YX1、W2、W8分别合成多肽并偶联KLH,以ISA50 V2作为佐剂,免疫小鼠三次。末次免疫后10天,每只鼠经口攻击旋毛虫肌幼虫400条。攻击后45天,收集肌幼虫并计数。与KLH对照组相比,W8组未产生免疫保护效果；W2组,YX1免疫组分别获得了31.5％和33.44％的肌幼虫减虫率。小鼠血清抗体总IgG、IgG1及IgG2a亚型分析结果显示,与KLH和PBS对照组相比,W2和YX1表位免疫小鼠后,血清中产生了抗Ts-Pmy的特异性抗体,IgG1较IgG2a水平明显增高,显示多肽免疫小鼠产生的抗体应答以Th2型免疫反应为主。
总之,通过以上实验,我们获得了Ts-Pmy的两个保护性抗原表位:YXI和W2。YX1是Ts-Pmy抗原与mAb7E2特异性识别的线性表位,W2是噬菌体展示肽的模拟表位。这两个表位多肽免疫小鼠后均可诱导产生有效的免疫保护作用。同时证实,与保护性单克隆抗体7E2识别的表位区位于Ts-Pmy的第88-107位氨基酸残基。以上结果提示:YX1和W2两个表位可作为候选疫苗组份,从而为制备抗旋毛虫病的多表位疫苗奠定了基础。