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巴贝斯虫病是由巴贝斯虫寄生在宿主红细胞中引起的一种血液寄生虫病,主要通过硬蜱传播。田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)感染动物和人,主要症状为发热、头痛、疲劳、贫血等,对免疫缺陷和免疫力低下的人群具有致死性,严重危害人类健康,是一种新发蜱传疾病。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白质,它和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,Trx R)、NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统,是硫氧还蛋白系统的重要组成部分。对疟原虫等血液原虫的研究发现,它们生存依赖氧化还原系统清除体内的氧化物,硫氧还蛋白系统发挥着氧化还原调节和抗氧化防御的核心功能。目前,巴贝斯虫硫氧还蛋白系统还缺少研究。本研究旨在鉴定田鼠巴贝斯虫Trx分子,为了解巴贝斯虫的硫氧还蛋白系统分子机制,发现药物靶点提供基础。本研究结果包括以下4个方面:一、通过田鼠巴贝斯虫转录组测序,利用生物信息学软件比对分析,筛选出田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白(Trx)基因序列。通过3’和5’RACE技术克隆全长田鼠巴贝斯虫Trx-2和Trx-3基因。氨基酸序列分析显示,田鼠巴贝斯虫Trx-2和Trx-3基因都具有典型的硫氧还蛋白结构域和WCGPC活性位点。二、构建了以p ET-30a为载体的重组表达质粒,转化至BL21感受态细胞,在1m M IPTG诱导下,成功进行了重组蛋白的表达,经亲和层析纯化,获得重组蛋白。三、胰岛素还原实验显示,重组Trx-2和Trx-3蛋白都有还原活性。Trx-2还原活性随反应时间增加不断增大,4分钟后达到平稳峰值;Trx-3还原活性迅速,即刻达到平稳峰值,与阳性对照组相似。四、通过Western blot鉴定,证明虫体Trx-2和Trx-3天然蛋白的分子量大小分别为15.5k Da和21.7k Da,且虫体在红细胞中分裂高峰期时Trx-2和Trx-3大量表达。间接免疫荧光实验(IFAT)证明Trx-2和Trx-3天然蛋白主要存在于细胞浆中。综上所述,本研究克隆了田鼠巴贝斯虫Trx-2和Trx-3全长基因,完成两个重组蛋白的表达和活性分析,确定了两个分子的大小和初步定位。为阐明巴贝斯虫的硫氧还蛋白抗氧化系统分子机制和筛选新型药物靶点提供基础。