论文部分内容阅读
先天性黑朦（LCA）是一类遗传性视网膜疾病。在正常人群中，该病的发病率约为1/30000到1/80000。LCA通常在患者出生后几个月即可发病，引起严重的视觉损伤甚至完全失明。LCA具有很高的临床异质性和遗传异质性，临床上，主要由以下4个特征来定义该症：严重且早发的视觉损伤、眼球震颤、黑朦性瞳孔和视网膜电生理反应消失。不同的患者可伴发不同的临床症状，包括圆锥形角膜、白内障、屈光不正、畏光、夜盲、智力退化、自闭症和嗅觉障碍等。同时，先天性黑朦的临床异质性还表现在患者视网膜表型的多样性。在遗传学方面，目前已经发现有26个基因与先天性黑朦有关，这些基因所编码的蛋白质涉及多种视网膜功能，如感光细胞形态的发生、光转导、视循环、鸟苷酸合成、感光细胞外节的吞噬以及感光细胞内的纤毛转运过程等。
LCA5基因定位在染色体6q14.1区域，由den Hollander等人在2007年克隆，其突变可导致常染色体隐性遗传的先天性黑朦。目前，已报道的LCA5基因致病突变有36个，其中29个为无义突变、移码突变和剪接位点突变，这些突变可能导致LCA5功能缺失。LCA5蛋白主要定位在感光细胞连接纤毛区域，可能与感光细胞外节蛋白的纤毛转运密切相关。在小鼠中敲除Lca5基因导致小鼠感光细胞渐进性退化，视杆细胞视蛋白Rhodopsin和红绿视锥视蛋白滞留在外核层，转导素和阻遏蛋白也出现了纤毛转运障碍。虽然LCA5与感光细胞纤毛转运相关，但其突变引起LCA的具体病理机制依然不清楚。
为了进一步探讨LCA5的致病机制，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了纯合型lca5基因敲除斑马鱼。通过ERG检测lca5-/-斑马鱼的视网膜功能，发现与野生型斑马鱼相比，7dpf的lca5-/-斑马鱼暗适应条件下的b波振幅下降约50%，提示其视觉功能缺陷。通过苏木精-伊红染色和免疫荧光实验对斑马鱼视网膜结构进行分析，发现在lca5-/-斑马鱼中，感光细胞渐进性变性，视锥细胞比视杆细胞变性发生的时间更早、且表型更为严重。在21dpf的lca5-/-斑马鱼中，视锥细胞外节膜盘结构碎裂，视杆细胞外节膜盘结构紊乱，而在7mpf的斑马鱼中，视锥细胞外节基本完全消失。我们的研究结果提示lca5基因敲除，可导致斑马鱼呈现视锥视杆营养不良的表型。这与小鼠中视杆细胞与视锥细胞均在早期出现严重变性的表型不同。
在lca5-/-斑马鱼中，红视锥视蛋白出现错误定位，在视网膜内节、外核层和突触末端可观察到其明显的定位信号。这种错误定位大约发生于15dpf的突变型斑马鱼中。而视杆细胞视蛋白和其它三种类型视锥细胞视蛋白则定位正常。检测视锥转导素α亚基（c-Tα）、视杆转导素α亚基（r-Tα）、G蛋白依赖的受体激酶1（GRK1）和G蛋白β亚基3（GNB3）在lca5-/-斑马鱼视网膜中的定位，我们发现c-Tα错误定位到了外核层和突触末端，其它三种外节蛋白则没有受到影响，我们的结果提示斑马鱼Lca5蛋白可能选择性地参与感光细胞外节蛋白的转运。
为探讨lca5基因敲除斑马鱼纤毛转运缺陷的原因，我们标记纤毛蛋白acetylated-α-tubulin来检测感光细胞纤毛的结构。通过测量感光细胞纤毛的轴丝长度，发现斑马鱼lca5基因并不影响感光细胞纤毛的生成。然而在lca5突变型斑马鱼中，IFT复合体B中的核心成分Ift88异常分布在整个纤毛结构中，且在5dpf的斑马鱼视网膜中这种异常分布已经发生。推测斑马鱼lca5基因功能缺失导致Ift88不能正常转运回纤毛基部，因而引起感光细胞纤毛转运缺陷。
综上所述，本研究构建了lca5基因敲除斑马鱼模型，发现该基因突变引起早发性的视觉缺陷和渐进性的感光细胞变性，视锥细胞比视杆细胞受患更早且表型更为严重。在突变型斑马鱼中，红视锥视蛋白和c-Tα选择性的错误定位到内节、外核层和突触末端。我们的斑马鱼模型较好地模拟了人类LCA5基因突变引起的先天性黑朦表型，为进一步开展LCA5的功能机制研究，以及先天性黑朦病人的预防和治疗研究打下了扎实的基础。
LCA5基因定位在染色体6q14.1区域，由den Hollander等人在2007年克隆，其突变可导致常染色体隐性遗传的先天性黑朦。目前，已报道的LCA5基因致病突变有36个，其中29个为无义突变、移码突变和剪接位点突变，这些突变可能导致LCA5功能缺失。LCA5蛋白主要定位在感光细胞连接纤毛区域，可能与感光细胞外节蛋白的纤毛转运密切相关。在小鼠中敲除Lca5基因导致小鼠感光细胞渐进性退化，视杆细胞视蛋白Rhodopsin和红绿视锥视蛋白滞留在外核层，转导素和阻遏蛋白也出现了纤毛转运障碍。虽然LCA5与感光细胞纤毛转运相关，但其突变引起LCA的具体病理机制依然不清楚。
为了进一步探讨LCA5的致病机制，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了纯合型lca5基因敲除斑马鱼。通过ERG检测lca5-/-斑马鱼的视网膜功能，发现与野生型斑马鱼相比，7dpf的lca5-/-斑马鱼暗适应条件下的b波振幅下降约50%，提示其视觉功能缺陷。通过苏木精-伊红染色和免疫荧光实验对斑马鱼视网膜结构进行分析，发现在lca5-/-斑马鱼中，感光细胞渐进性变性，视锥细胞比视杆细胞变性发生的时间更早、且表型更为严重。在21dpf的lca5-/-斑马鱼中，视锥细胞外节膜盘结构碎裂，视杆细胞外节膜盘结构紊乱，而在7mpf的斑马鱼中，视锥细胞外节基本完全消失。我们的研究结果提示lca5基因敲除，可导致斑马鱼呈现视锥视杆营养不良的表型。这与小鼠中视杆细胞与视锥细胞均在早期出现严重变性的表型不同。
在lca5-/-斑马鱼中，红视锥视蛋白出现错误定位，在视网膜内节、外核层和突触末端可观察到其明显的定位信号。这种错误定位大约发生于15dpf的突变型斑马鱼中。而视杆细胞视蛋白和其它三种类型视锥细胞视蛋白则定位正常。检测视锥转导素α亚基（c-Tα）、视杆转导素α亚基（r-Tα）、G蛋白依赖的受体激酶1（GRK1）和G蛋白β亚基3（GNB3）在lca5-/-斑马鱼视网膜中的定位，我们发现c-Tα错误定位到了外核层和突触末端，其它三种外节蛋白则没有受到影响，我们的结果提示斑马鱼Lca5蛋白可能选择性地参与感光细胞外节蛋白的转运。
为探讨lca5基因敲除斑马鱼纤毛转运缺陷的原因，我们标记纤毛蛋白acetylated-α-tubulin来检测感光细胞纤毛的结构。通过测量感光细胞纤毛的轴丝长度，发现斑马鱼lca5基因并不影响感光细胞纤毛的生成。然而在lca5突变型斑马鱼中，IFT复合体B中的核心成分Ift88异常分布在整个纤毛结构中，且在5dpf的斑马鱼视网膜中这种异常分布已经发生。推测斑马鱼lca5基因功能缺失导致Ift88不能正常转运回纤毛基部，因而引起感光细胞纤毛转运缺陷。
综上所述，本研究构建了lca5基因敲除斑马鱼模型，发现该基因突变引起早发性的视觉缺陷和渐进性的感光细胞变性，视锥细胞比视杆细胞受患更早且表型更为严重。在突变型斑马鱼中，红视锥视蛋白和c-Tα选择性的错误定位到内节、外核层和突触末端。我们的斑马鱼模型较好地模拟了人类LCA5基因突变引起的先天性黑朦表型，为进一步开展LCA5的功能机制研究，以及先天性黑朦病人的预防和治疗研究打下了扎实的基础。