论文部分内容阅读
麻疯树(Jatropha curcas L．)为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属多年生木本热带植物，源产于中美洲地区，在我国两广、云贵川和海南等地零星种植。种子富含油脂，种仁含油量高达60％左右，是公认的能源植物。另以其宜于生物制药、水土保持和生态修复等方面的诸多优点，而备受世人关注，但该树不耐低温和一年多花少果等不良性状，已成为麻疯树产业的突出问题。本论文以调控这些性状的上游转录因子入手，寻找与光周期和抗逆相关的Dof类基因，取得如下研究结果：
利用SMART技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建了麻疯树幼苗期低温cDNA文库。构建的诱饵质粒中的核心序列含有4个DRE元件和16个AAAAG元件，可以同时钓取DREB类和Dof类转录因子基因。经检测文库的转化率为1.24×107 cfu/μg pGADT7-Rec，文库滴度为2.48×106 pfu/mL，重组率为87%。检测结果显示了三种类型的基因：①与核心序列特异结合的Dof类和DREB类转录因子基因；②非特异结合的基因：包括MYB、NAC类转录因子基因、叶绿素a/b结合蛋白(Chlorophyll a/b binding protein)、组蛋白(Histone)和水通道蛋白(Aquaporin)等；③未知功能蛋白。
根据麻疯树低温酵母单杂交库的筛查结果，选择能与核心序列特异结合的三个Dof类转录因子基因进行深入的研究。将文库质粒测序结果和5’RACE的结果拼接，其全长cDNA分别为1910、1231和1924bp。通过生物信息学分析，开放阅读框分别为1558bp、1026bp和1416bp，命名为JcDof1、JcDof2和JcDof3。与已预测的其它物种的Dof进行序列和聚类分析，结果表明：JcDof1和JcDof3在Dof区域上游处各有一个内含子，与拟南芥中的AtCDF1-3、水稻OsRdd1-5和杨树、蓖麻、葡萄、向日葵等的未知功能的此类基因聚在一类；JcDof2中没有内含子，与拟南芥ADOF1和ADOF2聚在一类。
利用酵母单杂交系统验证了这三个蛋白的结合域和激活域功能，用亚细胞定位技术验证了它们的核定位功能，证明了它们是Dof类转录因子成员。采用Q-PCR技术检测JcDof1和JcDof3是一类光介导的生物钟基因，它们在不同的光照/黑暗条件下，表现出以24h为单位的有规律的震颤表达模式；在光敏色素-和隐花色素-感受传递光信号途径中可能各有分工；极有可能涉及到麻疯树的开花时间调控。
为了研究JcDof1-3基因的生物学作用，构建pCAMBIA1302-JcDof1-3过量表达双元载体，将其转入农杆菌EHA105中，通过沾花法直接转化拟南芥，获得T1代抗性植株。
为进一步验证这些基因在麻疯树中的功能以及进行分子改良，建立和优化了麻疯树组培体系和遗传转化系统。以麻疯树叶片为外植体，将其切成小片接种在含有1.5mg/L6-BA和0.05mg/LIBA的MS琼脂诱导培养基上，大约1个月后从叶片切口边缘分化出大量不定芽，出芽率近100%。将这些不定芽转接在生根培养基中，大约50%的可以生根成苗。在此基础上将麻疯树抗冷转录因子基因JcDREB，通过农杆菌介导法转化麻疯树叶片，经抗性筛选和PCR分子检测，已确定4株苗为阳性植株。