【摘 要】
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用重组大肠杆菌表达人组织型纤溶酶原激活剂衍生物(r-PA),得到的融合蛋白是没有活性的包涵体.目的蛋白质含有9对分子内二硫键,结构复杂,包涵体体外复性困难,收率很低.为提高
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用重组大肠杆菌表达人组织型纤溶酶原激活剂衍生物(r-PA),得到的融合蛋白是没有活性的包涵体.目的蛋白质含有9对分子内二硫键,结构复杂,包涵体体外复性困难,收率很低.为提高复性率,该文首先对包涵体复性前的处理方式进行了比较,包括Trx-r-PA包涵体的提纯、层析方法纯化包涵体以及该蛋白质在变性液中的衍生方式等.在复性操作中,针对不同处理方法的蛋白质变性液,研究了在不同凝胶分离范围介质上的复性,最佳分离介质上的尿素浓度梯度凝胶过滤柱上复性和复性过程的温度控制等.实验证明,包涵体变性溶解后,将变性液酸化,用Sephadex G25柱更换变性剂并脱除DTT后,衍生保护自由巯基,利用Sephacryl S-200尿素浓度梯度凝胶过滤变温操作进行柱上复性时,活性回收率比稀释复性工艺提高一倍以上,操作步骤大为简化,节约了成本和时间.对复性后的Trx-r-PA融合蛋白在ETI-SepharoseFF亲和柱上进行了酶切研究,柱上酶切的效率超过了液相酶切,且简化了操作步骤,缩短了操作时间,取得了理想的效果.
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