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5-3核糖核酸外切酶（XRN1，又称Xrn1p）是一个与RNA代谢和RNA干扰等重要功能相关的保守酶大家族，存在于所有真核生物中。XRN1能持续降解5端单磷酸的RNA，而不能对5端三磷酸、5帽子结构、5羟基的RNA发挥作用。在总RNA中，rRNA含量最高，原核生物的16S与23S rRNA和真核生物18S与28S rRNA5端均为单磷酸，末端核酸外切酶Xrn1p可将这些rRNA降解去除，而达到富集mRNA的目的。
酿酒酵母S288c的XRN1基因序列长4587 bp，编码1528aa。利用生物学软件预测其分子量和等电点，分子量约为175kDa，等电点在7.3左右。本论文采用大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统和真核家蚕细胞表达系统分别重组表达酿酒酵母S288c的XRN1，筛选高效表达XRN1重组蛋白的系统，为mRNA的富集奠定基础。
从酿酒酵母S288c中提取基因组，以基因组为模板，用高保真酶扩增XRN1基因，3端加A，进行TA克隆;再分别构建原核表达载体pET-DsbA-XRN1、pET-32a-XRN1（全长和截短），将经PCR、双酶切和测序鉴定的重组质粒转入表达菌中，筛选阳性克隆，诱导目的重组蛋白的表达，优化IPTG浓度，筛选最适的IPTG浓度，使目的蛋白以可溶形式表达量最高。结果表明，原核表达载体不能表达全长的XRN1重组蛋白，其中截短表达(ORF为3720 bp)的重组蛋白仅以包涵体形式表达，而截短表达(ORF为2785bp)的重组蛋白在IPTG浓度为0.2 mM时，上清中重组蛋白含量最高。以此IPTG浓度扩大诱导原核重组蛋白的表达，用镍柱亲和纯化可融表达的截短蛋白，再通过透析袋和超滤管浓缩，经Westernblotting鉴定，大小约为130 kDa，表明此重组蛋白即为目的蛋白，并用Bradford法测得重组蛋白酶液的浓度为1.356 mg/mL，最后将重组酶液用于活性鉴定，活性鉴定表明原核表达的截短蛋白具有5-3核糖核酸外切酶活性。
同时，构建毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K-XRN1，通过双酶切和测序鉴定，将鉴定无突变的重组载体用限制性内切酶SalⅠ线性化，电转化至毕赤酵母GS115、X33、SMD1168，筛选酵母重组子，鉴定表型，并进行诱导表达。结果表明，酵母胞内表达重组菌可以表达全长XRN1重组蛋白，经Western blotting鉴定其大小约在180 kDa，与目的蛋白大小相符。用Bradford法测得纯化浓缩后的真核蛋白酶液的浓度为0.789 mg/mL;活性检测表明，此重组蛋白具有5-3核糖核酸外切酶活性，且其活性高于原核截短表达的重组蛋白。
此外，构建真核表达载体pSK-XRN1（全长和截短），以GFP为对照，经双酶切、测序鉴定，将其通过脂质体转染家蚕细胞BmN，Western blotting检测蛋白表达，结果表明pSK载体可用于真核蛋白的表达，Western blotting检测有许多条带，其中在170 kDa左右见到较浓的条带，可能表达了重组蛋白。
本研究通过三种表达系统重组表达XRN1蛋白，分别得到了两种可以表达有活性的重组蛋白的工程菌，即原核截短表达重组菌和毕赤酵母胞内表达重组菌。它们表达的蛋白均可去除总RNA里的rRNA，可用于富集mRNA体系的构建。