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1、目的与意义随着我国经济的快速发展和人民生活水平的不断提高,糖尿病患病率呈逐年上升的趋势,已成为影响人民群众生命健康的重要疾病之一,受困于目前的医学水平,糖尿病依然是一种不可根治的疾病,并随着病程迁延诱发多种器官并发症,严重危害人类健康,同时给家庭和社会带来沉重的经济负担。据流行病学统计我国糖尿病患者已达9200万[2],其中90%-95%为Ⅱ型糖尿病(T2DM)。Ⅱ型糖尿病发病机制迄今尚不完全清楚,但普遍认为与遗传因素和多种环境因素相关。Ⅱ型糖尿病是以胰岛细胞受损和胰岛素抵抗为特征,引起体内胰岛素的分泌失常,糖、脂等综合代谢紊乱。其主要的临床表现为空腹血糖及餐后血糖异常,多饮、多食、多尿及体重减轻,并伴有高血脂、胰岛素敏感性下降(胰岛素抵抗)等,最后导致心、脑、肾、眼、神经血管等多种慢性并发症的发生[4]。由于Ⅱ型糖尿病病理机制的不确定性,临床治疗策略主要是控制糖尿病的进程,预防各种并发症,提高患者生存质量和延长寿命。在糖尿病的临床治疗中,二甲双胍是Ⅱ型糖尿病临床治疗的一线用药和联合用药中的基础用药,但由于二甲双胍在人体中具有累积性,可能导致罕见而严重的代谢性并发症,同时还存在着胃肠道方面的副作用,故“给予最低有效量”成为二甲双胍使用准则。梅连消渴胶囊是中药复方制剂,由乌梅、黄连、附子、干姜、细辛、人参、白术等组成,临床主要用于治疗Ⅱ型糖尿病,能有效改善糖尿病患者临床症状。本项研究采用小剂量梅连消渴胶囊协同小剂量二甲双胍,观察对实验性糖尿病大鼠的治疗作用,实验观察联合用药后是否产生“增效”的作用,即增加药物治疗效果,减少药物副作用,为中、西药联合应用提高治疗效果提供实验依据。2、实验方法2.1实验性Ⅱ型糖尿病模型复制、分组、给药剂量高脂高糖饲料喂养雄性SD大鼠5周后,禁食12小时,腹腔注射(ip)小剂量链脲佐菌素(STZ,30mg·kg-1),72小时后做口服糖耐量实验(OGTT),选择0时,2小时血糖分别大于7.0和11.1mmol·L-1的大鼠为合格Ⅱ型糖尿病大鼠模型,动物模型随机分为糖尿病模型组,二甲双胍组,梅连消渴胶囊组,梅连消渴胶囊联合二甲双胍组,连同正常对照组进入实验。药物组分别连续灌胃给药4周,正常对照组和糖尿病模型组灌胃同体积生理盐水。给药期间每天记录大鼠的饮水量和进食量,每周测定大鼠体重,每两周测定大鼠空腹血糖,实验周期结束时,检测大鼠口服糖耐量,末次给药后禁食12小时,腹主动脉取血,EDTA抗凝,测定大鼠糖化血红蛋白(HbAlc)含量。2.2实验性Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛细胞病理研究高脂高糖饲料喂养雄性SD大鼠5周后,禁食不禁水12小时后腹腔注射小剂量链脲佐菌素(30mg·kg-1),选择0时,2小时血糖分别大于7.0和11.1mmol·L-1的大鼠为合格Ⅱ型糖尿病大鼠,建立类似人类Ⅱ型糖尿病动物模型。实验动物模型随机分为糖尿病模型组,二甲双胍组,梅连消渴胶囊组,梅连消渴胶囊联合二甲双胍组,连同正常对照组进入实验。药物组连续灌胃给药4周,正常对照组及糖尿病模型组给予相同体积生理盐水。末次给药后禁食12小时,10%水合氯醛麻醉,取出胰腺放入中性福尔马林中固定。常规石蜡切片,HE染色,观察胰岛的病理变化。再每组随机抽取6只张胰腺病理切片,醛复红染色,观察胰岛β细胞数量的变化。2.3四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病模型复制、分组、给药剂量昆明种雄性小鼠,适应性饲养3天后禁食不禁水12小时,尾静脉(iv)注射小剂量四氧嘧啶(55mg·kg-1),正常对照组注射相应体积生理盐水。72小时后剪尾法测定小鼠禁食4后空腹血糖,选取血糖值在10～23mmol·L-1的小鼠作为合格的糖尿病小鼠模型。将合格的糖尿病小鼠模型随机分为糖尿病模型组、二甲双胍高剂量组、二甲双胍低剂量组、梅连消渴胶囊组、梅连消渴胶囊联合二甲双胍高剂量组和梅连消渴胶囊联合二甲双胍低剂量组,连同正常对照组进入实验。药物组连续灌胃给药4周,正常对照组及糖尿病模型组给予相同体积生理盐水。给药期间每天记录小鼠的饮水量和进食量,每周测定小鼠体重,每两周测定小鼠空腹血糖,末次给药后禁食4小时,摘眼球法取血,分离血清,放免法测定血清胰岛素(FINS)水平；摘取胰腺,中性福尔马林固定,常规石蜡切片,HE染色,观察小鼠胰岛的病理变化。3、实验结果3.1梅连消渴胶囊协同二甲双胍对实验性Ⅱ型糖尿病大鼠糖代谢的影响实验结果表明：与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠体重减轻(P＜0.05),耗食量和耗水量增加(P＜0.01),空腹血糖水平升高、糖耐量下曲线面积增加、糖化血红蛋白含量增加(P＜0.01)；与糖尿病模型组比较,二甲双胍组、梅连消渴胶囊组的耗食量和耗水量在给药4周后得到改善(P＜0.01)虽然空腹血糖水平、糖耐量下曲线面积、糖化血红蛋白含量有改善趋势,但无统计学意义。与糖尿病模型组比较,梅连消渴胶囊协同二甲双胍组的耗食量和耗水量减少(P＜0.01),空腹血糖和糖耐量下曲线面积明显降低(P＜0.05),糖化血红蛋白含量减少(P＜0.01)。3.2梅连消渴胶囊协同二甲双胍对实验性Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛的保护作用病理分析表明：胰岛病理评分等级资料χ2=29.836,P=0.000,胰岛p细胞计量资料F=46.434,P=0.000,表明组间差异有统计学意义。根据平均秩排列,糖尿病模型组胰岛受损最严重,次之是单纯给予梅连消渴胶囊组和二甲双胍组,梅连消渴胶囊协同二甲双胍组受损最轻。各给药治疗组中,梅连消渴胶囊协同二甲双胍组的p细胞所占比例最大,与模型组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。3.3梅连消渴胶囊协同二甲双胍对四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病的影响实验表明：与正常对照组比较,糖尿病模型组小鼠体重减轻(P＜0.05),耗食量和耗水量增加(P＜0.01),并一直维持在稳定水平；空腹血糖水平升高(P＜0.01),保持稳定；血清胰岛素水平低于正常对照组,但差异无统计学意义；胰岛细胞受损严重,病理评分差异明显有统计学意义(P＜0.01)。与糖尿病模型组比较,二甲双胍高剂量组(临床最高剂量)进食量和饮水量明显减少(P＜0.01)；空腹血糖水平下降(P＜0.05),并在实验周期内保持稳定；血清胰岛素水平和受损的胰岛细胞改善不明显。与糖尿病模型组比较,二甲双胍低剂量组(1/2临床最高剂量)进食量和饮水量减少(P＜0.01)；给药2周后空腹血糖下降明显(P＜0.01),给药4周后血糖水平有下降趋势,血清胰岛素水平略有升高,受损的胰岛细胞略有改善,但差异都无统计学意义。与糖尿病模型组比较,梅连消渴胶囊组(临床等效量)进食量和饮水量减少(P＜0.05)；空腹血糖仅在给药2周后下降明显,差异有统计学意义(P＜0.05)；血清胰岛素水平略有升高,受损的胰岛细胞略有改善,但差异都无统计学意义。与糖尿病模型组比较,梅连消渴胶囊协同二甲双胍高剂量组(梅连：临床等效量,二甲双胍：1/2临床最高剂量)进食量和饮水量减少(P＜0.05)；给药2周后空腹血糖下降明显,差异有统计学意义(P＜0.05),4周后空腹血糖有下降趋势,但差异无统计学意义；血清胰岛素水平有上升趋势,但差异无统计学意义；受损胰岛细胞无明显改善。与糖尿病模型组比较,梅连消渴胶囊协同二甲双胍低剂量组(梅连：临床等效量,二甲双胍：1/3临床最高剂量)进食量和饮水量减少(P＜0.01)；实验周期内空腹血糖水平不断下降,差异有统计学意义(P＜0.05)；虽然血清胰岛素水平有上升趋势,但无统计学意义；受损胰岛细胞无改善迹象。3.4实验性Ⅱ型糖尿病大鼠模型血糖、胰岛素、胰岛组织病理变化相关性分析通过高脂高糖饲料喂养以及低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射方法建立的实验性糖尿病大鼠模型,与临床Ⅱ型糖尿病患者的各检测指标都相近,其中血糖值和血清胰岛素水平均高于正常对照组,大鼠胰岛组织受到破坏,且破坏程度与血糖、胰岛素分泌量都呈正相关,最终导致胰岛功能受到损伤,表现出与Ⅱ型糖尿病相似的临床进程和发病机制。4、研究结论4.1联合用药后对实验性糖尿病大鼠一般临床症状改善作用单独使用梅连消渴胶囊、二甲双胍,或是协同使用,均能控制两种糖尿病模型的耗食量和耗水量。在实验结束时,动物出现的多饮、多食临床症状明显受到缓解。4.2梅连消渴胶囊协同二甲双胍对实验性糖尿病治疗增效作用梅连消渴胶囊协同二甲双胍治疗后明显地降低了糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白等一系列糖代谢指标,也明显降低了糖尿病小鼠模型的空腹血糖；对糖尿病大鼠胰岛β细胞的保护和修复作用也十分明显。4.3梅连消渴胶囊与二甲双胍联合用药剂量研究在显著降低空腹血糖的同时,梅连消渴胶囊协同二甲双胍治疗糖尿病小鼠中所用到的二甲双胍剂量仅为其单独使用时的三分之一。二甲双胍使用剂量减少,二甲双胍的副作用也就相应减少。