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组成型启动子如CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子和Ubiquitin(泛素)启动子等广泛应用于转基因植物外源基因的表达。组织特异启动子作为一类专一性启动子,能启动外源基因在植物发育过程中某一特定时空的表达,也能使目的基因的表达产物在一定空间积累,增加区域表达量。因此,寻找组织特异性启动子已成为植物基因工程的研究热点之一。
为了获得具有自主产权的特异诱导型启动子,本研究采用I-PCR的策略从浮萍基因组中克隆了长度为1491bp的一个新的rbcS基因启动子,并将其与GUS基因融合进行了组织表达、功能分析和5’端缺失分析,主要结果如下:
1.根据Genebank公布的浮萍rbcS基因序列设计简并引物,采用3’walking技术,从浮萍基因组中克隆了长度为1166bp的DNA序列,BLAST分析表明该序列1—295bp和1066-1164bp的序列与浮萍已有的7个rbcS基因序列的一致性在82—89%之间。这暗示该DNA序列可能是一个新的浮萍rbcS基因部分序列,将该基因命名为SSU5C,SSU5C从296 bp到1065bp的序列可能是一个内含子。
2.依据SSU5C基因295bp序列设计引物,采用I-PCR方法克隆了SSU5C基因的启动子。通过一轮I-PCR和nested-PCR克隆到了SSUSC基因上游1546的DNA片段。构建了含有该启动子全长的植物表达载体p1438-IGUS,在烟草稳定表达和烟草BY-2细胞瞬时表达证实该1438bp序列是SSU5C基因的启动子。
3.PLACE和PLANTCARE分析表明SSU5C启动子含有水杨酸、脱落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯等植物激素和葡萄糖等保守的顺式作用元件。采用T1转化烟草的实验证明:SSU5C启动子在正常光周期条件下受到水杨酸、植物生长素、细胞分裂素和茉莉酸甲酯的正调控,而受脱落酸和葡萄糖的负调控;在黑暗条件下受低浓度赤霉素负调控,正常光周期下受高浓度赤霉素正调控。葡萄糖可以抑制水杨酸对SSU5C启动子的正调作用,也可抑制ABA对SSU5C启动子的负调控作用。
4.SSU5C启动子是一个器官特异性启动子。在1—2月龄T1烟草,SSU5C启动子主要驱动GUS基因在烟草叶片和叶柄中表达,而在根部不表达,但在开花期GUS基因主要在叶片、萼片、花瓣着色部位花冠裂片以及花药和柱头中表达,在根、子房、花丝、花柱、花筒等部位不表达。SSU5C启动子不是一个强启动子,在叶片中它的GUS活性比35S启动子、烟草actin启动子、以及来自菊花的rbcS1启动子[1]的活性都低。
5.SSU5C启动子是一个受光调控的启动子。T1烟草在红光(660 nn)和远红光(730 nm),黑暗处理后白光和蓝光(450 nm)照射后,启动子的表达活性都均受到红光和蓝光以及白光的诱导正调控,表明SSU5C启动子是一个受到光敏色素和隐花色素调控的启动子。同时还证实,SSU5C启动子是依赖于叶绿体发育的,也受生物节律调控,与一般人bcS启动子的特点不同。
6.SSU5C启动子5’端缺失实验证实,SSU5C启动子在-152—1区域含受光调控的保守顺式作用元件区域,即box-X,box-Y,box-Z,该区域与浮萍SSU5B启动子对应区域类似。进一步的5’缺失实验表明,box-X,Y,Z都是受红光、远红光调控的顺式作用元件,证明box-Z在SSU5C启动子和SSU5B启动子分别具有不同功能。
7.作为一个光形态学形成有关基因的启动子,SSU5C启动子受到光和其它内源性植物生长调节剂以及外源性信号共同组成的复杂调控网络的共同协调调控。