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目的: 课题组前期实验发现知母皂苷AⅢ能显著抑制皮下荷瘤裸鼠模型中肿瘤的生长，本论文主要考察知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤细胞U87MG恶性增殖的机制。 方法: 1.知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤恶性增殖的体外实验 MTT法考察知母皂苷AⅢ、知母皂苷苷元、sGC激活剂(Riociguat,RIO)以及替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)对人脑胶质瘤细胞U87MG增殖的影响;流式细胞计数考察知母皂苷AⅢ对U87MG细胞周期和凋亡影响;QRT-PCR法考察知母皂苷AⅢ对U87MG细胞p21 mRNA的影响;Western-blot法考察知母皂苷AⅢ对U87MG细胞p21、Bcl-2、β-Catenin、CyclinD1、 p-ERK、T-ERK、p-p38、T-p38、p-JNK以及T-JNK蛋白的影响;采用JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580、两种抑制剂联用、两种抑制剂联用加知母皂苷AⅢ处理细胞考察细胞增殖和p21、β-Catenin蛋白的影响，利用WB考察知母皂苷AⅢ干预U87MG后对细胞核和细胞质中β-Catenin蛋白水平的影响。 2.考察PDE5在U87MG增殖中的作用及其机制 利用RNA干扰技术，转染PDE5A的干扰序列至U87MG细胞中，MTT法考察转染了knock down PDE5A对体外增殖的影响;QRT-PCR法考察转染后的细胞中PDE5A、Cyclin D1的基因表达水平;Western-Blot法考察转染后的细胞中PDE5A、PCNA、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的影响。 MTT法考察PDE5特异性抑制剂Tadalafil和cGMP入膜类似物8-Bro-cGMP对U87MG细胞体外增殖的影响，QRT-PCR法考察对药物处理后对U87MG细胞的Cyclin D1基因表达的影响;Western-blot法考察药物干预后U87MG细胞中PDE5A、PCNA、β-Catenin、Cyclin D1、p-VASPser239、T-VASP、p-ERK和T-ERK蛋白的影响。 3.基于cGMP通路分析知母皂苷AⅢ抑制U87MG增殖的作用机制 QRT-PCR法考察知母皂苷AⅢ对U87MG细胞的sGC-β、PDE5A、PKG-1α、PKG-1β基因水平的影响;Western-blot法考察对U87MG细胞的sGC-β、PDE5A、PKG-1蛋白的影响。用ELISA法检测知母皂苷AⅢ对U87MG细胞中cGMP含量的影响;WB法检测知母皂昔AⅢ对U87MG细胞中p-VASPser239、T-VASP的影响。 结果: 1.知母皂苷AⅢ、知母皂菅苷元、RIO以及TMZ对人脑胶质瘤细胞U87MG增殖呈剂量依赖性的抑制作用;知母皂苷AⅢ阻滞U87MG细胞在subG1期;知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性促进对U87MG细胞的早期凋亡。 2.知母皂苷AⅢ显著提升U87MG细胞p21的基因和蛋白水平的表达，而对Bcl-2、β-Catenin和CyclinD1的蛋白表达有显著的抑制作用。 3.知母皂苷AⅢ显著降低ERK蛋白磷酸化，同时提升p38和JNK蛋白的磷酸化水平;分别采用JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580、两种抑制剂联用、两种抑制剂联用加知母皂苷AⅢ处理细胞，发现抑制剂联用逆转了AⅢ处理后提高p21和降低β-Catenin的蛋白变化趋势，伴随着细胞活力恢复。暗示MAPK中的p38和JNK信号通路参与知母皂苷AⅢ的抗增殖机制。 4.知母皂苷AⅢ干预后，核内β-Catenin的蛋白表达显著下降，而细胞质中的β-Catenin蛋白表达无显著变化，暗示抑制β-Catenin的核转移。 5.从基因学和药理学水平抑制PDE5后，PDE5A的基因和蛋白水平均下调，同时伴随着U87MG的增殖下降。Knock down PDE5A后CyclinD1的基因和蛋白表达均下调，β-Catenin及PCNA的蛋白表达也显著降低。PDE5A特异性抑制剂Tadalafil和cGMP入膜类似物8-Bro-cGMP分别在1μM和1000μM显著抑制PDE5A、 CyclinD1蛋白的表达，伴随着U87MG体外增殖力的显著下降。 6.知母皂苷AⅢ抑制U87MG细胞PDE5A、PKG-1α和PKG-1β的基因水平的表达，与此同时提高sGC-β的基因表达，蛋白水平的变化趋势与基因水平一致，即提高sGC-β和PKG-1的蛋白表达，抑制PDE5A的蛋白表达。知母皂苷AⅢ提高U87MG细胞中cGMP含量，同时也提高VASP在ser239位点上的磷酸化水平。 结论: 1.知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性抑制U87MG细胞的增殖，阻滞U87MG细胞在subG1期并呈剂量依赖性促进U87MG细胞的早期凋亡。 2.知母皂苷AⅢ部分通过MAPK和β-Catenin信号通路，提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平，抑制ERK蛋白的磷酸化水平，抑制β-Catenin的核转移，提高p21和抑制Bcl-2抗凋亡蛋白和CyclinD1细胞周期相关蛋白的表达，从而抑制人脑胶质瘤细胞U87MG的体外增殖。 3.从基因学上敲低或从药理学上抑制PDE5A均可抑制U87MG的体外增殖，且与CvclinD1蛋白表达相关，暗示PDE5是干预脑胶质瘤恶性增殖的潜在靶点，可能通过β-Catenin信号传导途径发挥作用。 4.知母皂苷AⅢ部分通过提高sGCβ表达和抑制PDE5A的表达，从而提高细胞内cGMP含量，活化PKG-1，提高VASP ser239位点的磷酸化水平，暗示其可活化人脑胶质瘤细胞U87MG中cGMP信号通路而抑制其增殖。