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目的: 1、体外培养人脂肪源性间充质干细胞及黄芪甲苷孵育的脂肪源性间充质干细胞，以PKH26红色荧光染料标记，观察PKH26标记对干细胞形态、增殖、表面分子表达有无影响; 2、通过缺血再灌注及顺铂诱导急性肾损伤小鼠模型，确定最适造模方式及最佳条件; 3、研究PKH26标记的人脂肪源性间充质干细胞及黄芪甲苷孵育的脂肪源性间充质干细胞体内移植对急性肾损伤小鼠的影响及相关作用机制。 方法: 1、根据前期筛选的黄芪甲苷(Ast)孵育人脂肪源性间充质干细胞(hADSC)的最佳孵育条件，选取P3-P5代细胞进行试验。以PKH26标记hADSC及Ast-hADSC，细胞贴壁后光镜下及荧光显微镜下观察细胞形态;Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测hADSC、Ast-hADSC的阳性标记率及细胞表面标志物的表达（CD分子）。 2、缺血再灌注及顺铂诱导急性肾损伤小鼠模型:缺血再灌注组小鼠分为Sham组、30min组、40min组及45min组，分别夹闭双侧肾蒂30、40、45min后再灌注;顺铂诱导组则腹腔注射不同浓度顺铂（12.5、15、20mg/kg及10mg/kg两次注射），通过观察各组小鼠血肌酐及尿素氮的变化、肾组织病理学变化（HE染色及ATN评分）、肾细胞凋亡情况(TUNEL)来确定最适造模方式及最佳建模条件。 3、确立最佳建模条件后建立小鼠AKI模型，于建模24h后分别尾静脉输注1×105/100ul的hADSC及Ast-hADSC细胞悬液，以注射100μl生理盐水的AKI小鼠作为模型对照，以正常小鼠作为正常对照，于输注细胞悬液后1d、3d、7d、14d留取小鼠血清作血肌酐及尿素氮检测;留取肾组织标本观察肾组织病理学改变、TUNEL法检测肾细胞凋亡情况;ELISA检测肾组织匀浆中TNF-α、IL-6、RANTES的水平;免疫组化检测PCNA及VEGF的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达;激光共聚焦观察hADSC及Ast-hADSC在肾组织分布以及转分化情况。 结果: 1、PKH26标记情况:PKH26标记后hADSC及Ast-hADSC两组细胞形态上无明显差异，呈梭形、成纤维细胞样，漩涡状、放射性生长;荧光镜下可见细胞胞膜、胞浆发出红色荧光。流式细胞仪结果显示，hADSC与Ast-hADSC两组细胞PKH26阳性标记率分别为99.7％ vs100％，表面分子的表达分别为CD29(99.4％ vs99％)、CD44(99.9％ vs99.8％)、CD34(0.3％ vs0.2％)、CD45(0.3％ vs0.3％);CCK8检测结果显示，随着孵育时间延长，对照组细胞以及经PKH26标记后的hADSC及Ast-hADSC组细胞增殖逐渐增加，72h后细胞增殖速度减缓，各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。 2、AKI小鼠模型的建立:缺血再灌注组建模24h后血Scr、BUN和ATN评分明显升高，与Sham组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05);TUNEL染色显示随着缺血时间的延长，凋亡阳性细胞数逐渐增多，肾组织损伤程度加重，45min组部分肾小管坏死。顺铂诱导组建模24h后血Scr、BUN和ATN评分逐渐升高，与control组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，随着顺铂浓度的升高，Scr、BUN上升幅度相对较小，TUNEL染色显示10 mg/kg两次注射组凋亡阳性细胞数相对较多，ATN评分提示肾小管轻中度损伤。选取隔日两次10mg/kg顺铂腹腔注射作为后期体内试验的最佳造模方式及条件。 3、hADSC及Ast-hADSC干预后对AKI小鼠的影响 ①血Scr、BUN水平:建模24h后，损伤各组血Scr逐渐上升，在第3d达到最高值，此后呈下降趋势，与model组各时间点比较，干细胞干预两组第3、7、14d Scr水平显著低于model组，差异均具有统计学意义(P＜0.05); hADSC组与Ast-hADSC组两组间各时间点差异无统计学意义(P＞0.05)。建模24h后各损伤组BUN逐渐上升，至第7d达到最高值，与model组各时间点比较，干细胞干预两组第3、7、14d Scr水平显著低于model组，差异具有统计学意义(P＜0.05);与hADSC组比较，Ast-hADSC组14d BUN水平明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 ②病理学改变:HE染色观察可见normal组小鼠肾组织结构基本正常，model组小鼠肾小管上皮细胞空泡变性，刷状缘脱落明显，管腔中可见脱落的肾小管上皮细胞，以建模后第1d最严重，随着建模时间延长，肾小管损伤有一定的自身修复，至14d仍可见少量上皮细胞空泡变性;与同时间点model组相比，给予hADSC和Ast-hADSC干预后，小鼠肾小管损伤明显减轻;Ast-hADSC组尤为明显，至14d时可基本恢复至正常水平。 ③肾组织细胞凋亡情况:normal组未见明显细胞凋亡，顺铂损伤各组均可见不同程度的凋亡阳性细胞表达，以建模后前3d最为严重，第7d、14d凋亡阳性区域明显减少;与model组比较，hADSC及Ast-hADSC两组各时间段凋亡阳性区域明显减少，其中Ast-hADSC组优于hADSC组，至14d时可基本恢复至正常水平。 ④肾组织中各炎症因子的表达:ELISA结果显示建模初期损伤组小鼠肾组织TNF-α、IL-6、RANTES水平较正常组显著升高，随着时间延长，小鼠肾组织各炎症因子水平有逐渐下降趋势，但仍较正常组升高;hADSC组和Ast-hADSC组各时间点TNF-α、IL-6、RANTES的水平较同时间点model组明显下降(P＜0.05)，其中Ast-hADSC组各炎症因子水平低于hADSC组（部分时间点P＜0.05）。 ⑤肾组织中PCNA、VEGF的表达正常组小鼠肾组织几乎不表达PCNA、VEGF，与正常组比较，顺铂损伤各组小鼠不同时间点PCNA、VEGF表达明显增加，以第1d、3d最为显著，随着时间的延长，PCNA、VEGF表达逐渐减少;与model组比较，hADSC和Ast-hADSC两组各时间点肾组织PCNA、VEGF表达明显增多，其中Ast-hADSC组优于hADSC组，至损伤后期同时间点仍有较高的表达。 ⑥各组小鼠肾组织匀浆Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达normal组小鼠肾组织表达极少量的caspase-3及少量Bax、Bcl-2蛋白，与normal组比较，顺铂损伤各组caspase-3、Bax活性蛋白表达明显增加;与model组比较，hADSC及Ast-hADSC两组各时间点caspase-3、Bax活性蛋白表达减少，其中以Ast-hADSC组蛋白表达减少趋势更为明显。与normal组比较，顺铂损伤各组初期Bcl-2蛋白少量表达，至损伤中后期Bc1-2蛋白表达量增加;与model组比较，hADSC及Ast-hADSC两组各时间点Bcl-2蛋白表达量明显增加。 ⑦ADSC在肾组织的分布及分化:激光共聚焦结果显示，1、3、7d各组均未见红色荧光标记的hADSC及Ast-hADSC表达;至14d，hADSC及Ast-hADSC组肾组织有少量红色荧光表达，其中少量红色荧光与肾小管上皮细胞呈融合状态;normal组及model组未见红色荧光表达。各组各时间点小鼠肾组织未见红色荧光标记的hADSC及Ast-hADSC与绿色荧光标记的CK18、AQP1相重叠状态。 结论: 1、PKH26标记对细胞形态、细胞增殖及表面分子表达无明显影响，基本保持了hADSC及Ast-hADSC的生物学特性，这对后期干细胞体内移植提供了强有力的保证。 2、在成功建立急性肾损伤模型的基础上，考虑时间的控制、肾组织损伤的程度以及个体误差最小化，选取隔日两次10mg/kg顺铂腹腔注射作为最佳建模条件。 3、hADSC移植可改善顺铂诱导的AKI小鼠的肾脏结构和功能损伤，其修复作用可能与改善肾功能、减少细胞凋亡、抑制炎症因子分泌、促增殖、调控肾小管细胞凋亡相关蛋白表达以及hADSC向受损的组织迁移归巢密切相关;经Ast孵育后，可在一定程度上提高hADSC对受损肾组织的修复作用。