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乙酰乙酸内酰胺类天然产物(Tetramic acid)广泛存在于微生物产生的次级代谢产物中，具有非常显著的抗菌，抗病毒和抗癌的生物活性。其中比较独特的分子是分离于Streptomyces rugosporus LL-42D005(NRRL21084)具有强抑菌活性的吡咯吲哚霉素(Pyrroindomycins，PYRs)，包含有A，B两种组分。PYR是在自然界中发现的首例拥有螺环乙酰乙酸内酰胺结构的抗生素，其在结构上非常类似于螺环乙酰乙酸内酯类抗生素。后者的结构主要由萘环和一个以螺环方式与己烯环相连的Tetronic acid结构单元组成的大环聚酮骨架，加上不同程度的糖基化修饰而成，其代表分子有Chlorothricin(CHL)，Tetrocarcin A(TCA)，Kijanimicin(KIJ)以及Abyssomicin(ABY)。PYR的大环结构比较复杂，其立体结构至今尚未阐明。我们选择吡咯吲哚霉素作为研究对象，以期在分子和生化水平上阐明其生物合成途径，特别是其中乙酰乙酸内酰胺结构单元形成的酶学机制，为利用组合生物合成的手段创造分子结构的多样性提供基础。
我们首先以黏粒pCC1FOS为载体，构建了PYR产生菌Streptomycesrugosporus LL-42D005的基因组文库。根据与此家族特征性结构单元乙酰乙酸内酯/内酰胺合成相关的α/B-水解酶的保守序列设计简并性引物，以S。rugosporus LL-42D005的总DNA为模板，通过PCR扩增克隆了α/β-水解酶的基因片段。以该片段为探针，对基因组文库进行筛选。结合文库筛选和染色体步移，最终我们获得了105 kb大小的PYR完整生物合成基因簇，共包含48个开放读码阅读框(orf)。我们将其中的基因pyrB通过基因中断实验证实了其与PYR生物合成相关。基于基因簇中各个基因功能的生物信息学分析，我们提出了PYR生物合成的大致途径。即在聚酮合成酶PKS的催化下以Acetyl CoA为起始单元，Malonyl CoA，MethylMalonyl CoA，和EthylMalonyl CoA为延伸单元连续进行10次的缩合反应形成和酶偶联的不饱和聚酮中间产物，接着和由聚肽合成酶NRPS上载的丝氨酸发生缩合、环化将聚酮中间产物从PCP上解离下来，经过羟基脱水形成双键，发生两次Diels-Alder反应，形成Tetramic acid单元以螺环方式与己烯环相连的中间产物，随后大环骨架C29位的甲基被氧化形成羧酸，再经过几步糖基化修饰，最后上载吡咯吲哚结构单元完成新型抗生素PYR的生物合成。
我们推测PyrD3、PyrD4参与五元内酰胺的环合反应，因此我们对pyrD3和pyrD4以及pyr(D3+D4)分别做了同框敲除实验。实验结果表明单独敲除pyrD3或者pyrD4都不能终止PYR的生物合成，但同时敲除pyrD3和pyrD4可以完全阻断PYR的产生。这部分实验证实了尽管pyrD3(2-oxoaciddehydrogenases acyltransferase同源)和pyrD4(hydrolase同源)属于两类不同的酶但其发挥的功能却具有互补性。
我们还通过体外酶学实验证实了五元内酰胺骨架是由PyrD3或者PyrD4催化环合。我们首先合成出了PYR五元内酰胺环化之前的模拟底物；而后利用体外纯化的PyrD3和PyrD4考察五元内酰胺的关环反应。通过实验证实了PyrD3或PyrD4可以以相似的速率催化五元内酰胺的环合。
总之，我们克隆了PYR的生物合成基因簇，基于基因簇各基因的功能分析提出了PYR大致的生物合成机制。并通过一系列体内及体外的实验研究了其中几个重要基因的功能，阐明了PYR五元内酰胺环的生物合成机制。