论文部分内容阅读
研究表明，mRNA5端非转录区（mRNA5-UTR）内富含鸟嘌呤的序列能够形成RNA G-四链体结构，由于其结构和功能对基因表达，转录调控具有重要作用，且与肿瘤的发生、发展密切相关，RNA G-四链体结构已经成为非常有潜力的恶性肿瘤早期检测标志物以及新型抗肿瘤药物设计新靶点。基于RNA G-四链体的结构和性质，本文设计和筛选了对mRNA5-UTR中RNA G-四链体具有高灵敏度，高特异性识别能力的分子探针，通过探针对RNA G-四链体的特异性识别进一步开展对活细胞中与恶性肿瘤相关RNA G-四链体的原位准确检测，从而为实现对恶性肿瘤的早期预警与检测奠定基础。主要研究如下: 1.筛选出一种高灵敏度，高特异性的分子探针实现对RNA G-四链体的精确识别: 基于RNA G-四链体对基因表达，转录调控的重要作用，高通量筛选了一种高灵敏度，高特异识别RNA G-四链体的分子探针。该探针能够选择性的识别RNA G-四链体，对RNA G-四链体的特异性识别高达600倍的显著荧光增强，而与其它结构类型的RNA（例如:单链RNA，发夹式RNA以及tRNA）作用，其荧光的变化几乎可以忽略不计。最重要的是，该探针还能够有效的识别非连续RNA G-四链体。因此，该探针不仅能够简单准确地识别RNA G-四链体，也为非连续RNA G-四链体的检测识别提供了新的方法。 2.筛选出一种长波长荧光分子探针，实现RNA G-四链体在活细胞中的原位检测: 由于RNA G-四链体与肿瘤的发生、发展密切相关，设计了一种能够对人类肿瘤活细胞中RNA G-四链体实现实时原位检测的菁染料分子探针。我们构建的菁染料CyT分子探针能够与RNA G-四链体发生强烈的相互作用，该探针与RNAG-四链体相互作用后，由聚集体形式转换为单体形式并在595nm处发出强的荧光，荧光增强倍数高达1800倍。该探针能够在溶液、胶体、细胞等多个体系中实现对RNA G-四链体的检测。该探针也在国际上首次实现了RNA G-四链体的实时原位检测，这为恶性肿瘤的早期诊断和检测提供了坚实的理论基础。 3.基于RNA G-四链体和DNA G-四链体结构的微小差异性，开发设计了一种能够精确分辨RNA G-四链体和DNA G-四链体的分子探针: 由于富含鸟嘌呤的RNA序列形成的RNA G-四链体与许多重要的生物过程和人类疾病相关，所以能够特异性识别RNA G-四链体结构的荧光探针对于发现其生物学功能至关重要，然而，目前的大多数RNA G-四链体探针也能与DNA G-四链体发生强的相互作用。由于RNA G-四链体和DNA G-四链体在生物过程中的作用和功能完全不同，所以我们迫切需要寻找一种有效的分子探针来区分RNA G-四链体和DNA G-四链体。基于此，我们筛选出了杨梅素(Myr)，它与RNA G-四链体作用后表现出显著的荧光发射，而与DNA G-四链体作用后却几乎没有荧光响应。深入的分子机制研究表明，Myr对RNA G-四链体的特异性识别主要是由于探针选择性结合于RNA G-四链体的G平面上，并与G平面中G核苷酸上的2-羟基形成氢键而引起，显著的荧光响应主要来源于G平面与探针之间的能量转移。Myr高特异性和高灵敏度的识别RNA G-四链体结构对于未来基于RNAG-四链体为靶标的疾病诊断技术提供了新的思路。