论文部分内容阅读
目的:本研究以原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对象,采用尼古丁干预,明确尼古丁刺激对人脐静脉内皮细胞自噬功能影响,探讨自噬在尼古丁诱导的内皮细胞损伤中的作用及其可能机制。方法:人脐静脉内皮细胞经不同浓度尼古丁干预6h,采用Western Blot蛋白免疫印迹技术检测细胞中自噬标记蛋白LC3Ⅱ及自噬相关蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表达水平;Western Blot检测6×10-8M及6×10-6M尼古丁作用于HUVEC不同时间(0h、1.5h、3h、6h、12h)时LC3Ⅱ、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表达变化;采用流式细胞术检测6×10-6M、6×10-8M尼古丁干预人脐静脉内皮细胞6h时的凋亡率;运用基因沉默技术敲除HUVECs中AMPKα基因,利用Western Blot技术检测LC3Ⅱ和AMPKα蛋白表达,运用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1.不同浓度尼古丁干预HUVECs时,LC3Ⅱ蛋白表达具有浓度依赖性呈上调趋势,6×10-6M尼古丁作用下LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.01)。然而,Beclin-1表达与LC3Ⅱ的变化并不完全一致:低浓度尼古丁(6×10-9M、6×10-8M)作用下Beclin-1与对照组相比升高(P<0.01),高浓度下(6×10-7M和6×10-6M)Beclin-1与对照组相比降低(P<0.01)。LAMP-2蛋白表达与Beclin-1变化一致。有趣的是,SQSTM1/p62蛋白表达与Beclin-1、LAMP-2完全相反。2.6×10-8M、6×10-6M尼古丁分别干预HUVEC不同时间段,LC3Ⅱ蛋白在6h处表达水平升高显著(P<0.01)。同时,6×10-6M尼古丁干预下LAMP-2表达下调明显,SQSTM1/p62蛋白表达升高显著(P<0.01),然而,6×10-8M尼古丁干预下LAMP-2与SQSTM1/p62蛋白表达变化与6×10-8M尼古丁干预时相反。3.6×10-8M尼古丁处理组与对照组相比,凋亡率差异不具有统计学意义(P?0.05);6×10-6M尼古丁处理组与对照组相比,凋亡率显著升高(P<0.001);6×10-6M尼古丁处理组与6×10-8M尼古丁处理组相比,凋亡率显著升高(P<0.001)。4.尼古丁可磷酸化AMPKα。基因沉默AMPKα后发现,6×10-8M尼古丁+AMPKαsiRNA(AMPKsiRNA)实验组与6×10-8M(consiRNA)尼古丁实验组相比,LC3Ⅱ表达明显下调(P<0.001),凋亡率显著升高(P<0.001)。结论:1.尼古丁可影响人脐静脉内皮细胞自噬,具有浓度和时间依赖性。2.自噬水平升高可拮抗尼古丁诱导的内皮细胞凋亡,相反,自噬功能紊乱不利于内皮细胞存活。3.AMPK介导的自噬在抑制尼古丁诱导的内皮细胞凋亡中起关键作用。