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登革病毒(dengue virus,DENV)和乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科黄病毒属,是蚊媒传播的病毒性传染病病原体,其中登革病毒可引起严重的登革热、登革出血热和登革休克综合症,但目前尚无有效的抗登革病毒感染的药物和疫苗,因此在研究登革病毒的感染致病机理的基础上,开展抗登革病毒药物筛选和特效疫苗的开发具有重要意义。
本研究主要分为两个部分,分别以登革病毒非结构蛋白NS1和几种黄病毒E蛋白domainⅢ为研究对象,开展了登革病毒NS1的功能及其在病毒复制中的作用及几种黄病毒ED3蛋白对乙型脑炎病毒的特异性保护作用机理的研究:
1登革病毒非结构蛋白NS1的功能研究
登革病毒NS1蛋白是一个高度保守的非结构蛋白,分子量约为46kDa,是病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白,含有2个糖基化位点和12个保守的半胱氨酸。NS1参与病毒的复制和病变形成,可能对病毒的致病机理和诱导机体的免疫反应中起重要作用,但目前关于其参与病毒复制的机制还不完全清楚,缺乏晶体结构是制约相关机制阐明的一个原因。登革病毒感染的细胞中NS1定位于细胞质和细胞膜,并可以分泌到胞外。本研究通过分析NS1的氨基酸序列和二级结构,发现NS1蛋白的N端和C端均含有抗原表位,可以与抗NS1多克隆抗体发生交叉反应。以登革病毒复制子和全长感染性克隆为平台,分别对NS1蛋白的2个N端糖基化位点(N130和N207)、3个半胱氨酸位点(C4、C5和C291)、1个疏水区谷氨酸残基位点(E173)和C端20个氨基酸多肽进行点突变和缺失突变,分析它们在病毒复制中的作用。采用含有报告基因的DENV-2复制子分析表明,N130A、E173A不影响病毒复制;C55A、N207A和C291A使病毒复制显著削弱;C4A和C-末端序列的缺失完全阻断了病毒的复制。Real-time PCR结果表明,C4A、C55A、C291A和缺失突变体病毒RNA水平明显低于野生型病毒,盲传后发现病毒的感染性明显下降。推测NS1中的N207、C4、C55、C291和C-末端片段可能参与病毒的复制过程,其中N207糖基化位点可能参与NS1功能结构的形成,二硫键和C末端疏水区对于维持NS1的三级结构有关键作用。同时表明NS1的结构对病毒的复制有重要的影响,为进一步研究抗病毒机理提供理论依据。
2黄病毒E蛋白domainⅢ对乙型脑炎病毒抑制作用的研究
E蛋白domainⅢ位于蛋白C末端,折叠成稳定构象,暴露在病毒颗粒表面,其表位可引起病毒中和抗体,还可以帮助识别细胞表面的受体和共受体。本研究中,我们对乙型脑炎病毒、1-4型登革病毒、西尼罗病毒的E蛋白domainⅢ进行了克隆、表达、复性和纯化。由于缺乏结构域Ⅰ和Ⅱ,E蛋白同源二聚体中的疏水区暴露,导致ED3溶解度较低。通过对大肠杆菌表达的ED3包涵体进行变性和复性过程,帮助蛋白进行正确折叠,得到了部分可溶的黄病毒ED3纯化蛋白。实验结果发现,重组的JEV-ED3对病毒感染BHK-21细胞的抑制力超过50%,同时对比其他重组黄病毒ED3对病毒感染细胞的交叉保护作用发现,其抑制力可高达50-70%,且与蛋白浓度呈正相关,说明病毒颗粒表面可与BHK-21细胞结合的粘附或受体因子或为黄病毒所共有。中和试验表明,特异的中和抗体能够干扰病毒与受体的结合,抗JEV-ED3多克隆抗体对JEV能够表现出很好的中和作用,相反DENV1、DENV4和WNV-ED3抗体对JEV中和力弱,DENV2-ED3、DENV3-ED3抗体表现出一定的中和保护力。
综上所述,比对黄病毒ED3序列发现其在氨基酸水平上存在较大的变异,保守性并不高,因此不同黄病毒ED3的中和表位差异性较大,其诱导机体产生的抗体对JEV的中和作用弱。而由于黄病毒ED3结构上的相对保守性,推测其保守区域位点可能形成相似的结构,对病毒识别细胞受体有重要作用,为进一步了解黄病毒感染细胞的分子机制和研制疫苗提供理论依据。