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目的：
1.探讨CHIP不同表达状态在三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化位点中的调控机制。
2.阐明CHIP不同结构域在CHIP调控三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化中所发挥的具体机制。
方法：
1.选择小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)作为实验材料，选取对数生长期的细胞进行1mmol/LAlCl3染毒及CHIP质粒转染，实验分为两部分：一是观察CHIP过表达对染铝细胞tau蛋白的影响，实验分组为:正常对照组，1mmol/LAlCl3组，空质粒组，CHIP质粒转染组，CHIP质粒转染+1mmol/LAlCl3组；二是观察CHIP干扰对染铝细胞tau蛋白的影响：正常对照组，1mmol/LAlCl3组，CHIPshRNA阴性对照组，CHIPshRNA组，CHIPshRNA+1mmol/LAlCl3组；
2.选择细胞系同上，对细胞进行1mmol/LAlCl3染毒及CHIP不同结构域质粒转染，实验分为两部分：一是观察CHIP(ΔU-box)在CHIP调控铝致tau蛋白异常磷酸化中的作用，实验分组为：正常对照组，1mmol/LAlCl3组，空质粒组，CHIP(ΔU-box)质粒转染组，CHIP(ΔU-box)+1mmol/LAlCl3组；二是观察CHIP(ΔTPR)在CHIP调控铝致tau蛋白异常磷酸化中的作用，实验分组为：正常对照组，1mmol/LAlCl3组，空质粒组，CHIP(ΔTPR)质粒转染组，CHIP(ΔTPR)+1mmol/LAlCl3组。
上述处理结束后，收集细胞并提取总蛋白样品，采用Westernblot的方法分别检测tau-5，pThr181，pThr231，pSer262，pSer396，CHIP，Hsp70及Ub的蛋白表达水平，通过免疫共沉淀的方法检测CHIP与tau-5，pThr181，pThr231，pSer262，pSer396，Hsp70及Ub的相互作用。
结果：
1.N2a细胞CHIP过表达
1.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝可引起CHIP，Ub，pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著增高(P＜0.05)；CHIP过表达引起CHIP和Ub蛋白表达水平显著增高(P＜0.05)，pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。经析因分析显示，在N2a细胞中CHIP过表达与AlCl3染毒在CHIP，Ub和pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
1.2免疫共沉淀结果显示：利用anti-CHIP进行IP所得免疫沉淀复合物用WB检测到Hsp70，Ub与tau蛋白pThr231，pSer262，pSer396磷酸化位点，说明CHIP与Hsp70，Ub,tau蛋白及其各磷酸化位点之间存在相互作用。
2.N2a细胞CHIP干扰
2.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝可引起CHIP，Ub和pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)；CHIP干扰引起CHIP和Ub蛋白表达显著降低(P＜0.05)，pThr231，pSer262，pSer396表达均有明显升高(P＜0.05)。经析因分析显示，在N2a细胞中CHIP干扰与AlCl3染毒在CHIP，Ub和pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
3.N2a细胞CHIP(U-box)结构域质粒转染
3.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝引起CHIP，Ub和pThr31231，pSer262，pSer396蛋白表达均显著升高(P＜0.05)；CHIP(ΔU-box)结构域转染引起pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。经析因分析结果显示，CHIP(ΔU-box)结构域转染和染铝在CHIP和Ub的蛋白表达变化中不存在交互作用，而在pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
3.2免疫共沉淀结果显示:利用anti-Myc进行IP，得到的免疫沉淀复合物用WB在CHIP(ΔU-box)转染组和CHIP(ΔU-box)+1mmol/LAlCl3组中未检测到Hsp70，Ub以及tau蛋白pThr231，pSer262，pSer396各磷酸化位点与CHIP之间的相互作用。在各组免疫沉淀复合物中均能检测到Myc-CHIP。
4.N2a细胞CHIP(TPR)结构域质粒转染
4.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝引起1mmol/LAlCl3组CHIP，Ub，pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)；CHIP(ΔTPR)结构域转染引起pThr231，pSer262，pSer396表达显著升高(P＜0.05)。经析因分析结果显示，CHIP(ΔTPR)结构域转染和染铝在CHIP和Ub的蛋白表达变化中不存在交互作用，而在pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
4.2免疫共沉淀结果显示:利用anti-Myc进行IP所得免疫沉淀复合物用WB检测到Hsp70，Ub与CHIP存在相互作用。在CHIP(ΔTPR)质粒转染组、CHIP(ΔTPR)+1mmol/LAlCl3组中检测到myc-CHIP；在CHIP(ΔTPR)质粒转染组、CHIP(ΔTPR)+1mmol/LAlCl3组中未检测到pThr231，pSer262，pSer396与CHIP之间相互作用。
结论：
1.CHIP参与了铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化的调控，且主要调控位点是pThr231、pSer262、pSer396位点。
2.CHIP不同结构域在铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化的调控过程中各自发挥了重要作用，二者必须共同存在发挥作用，缺一不可。
1.探讨CHIP不同表达状态在三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化位点中的调控机制。
2.阐明CHIP不同结构域在CHIP调控三氯化铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化中所发挥的具体机制。
方法：
1.选择小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)作为实验材料，选取对数生长期的细胞进行1mmol/LAlCl3染毒及CHIP质粒转染，实验分为两部分：一是观察CHIP过表达对染铝细胞tau蛋白的影响，实验分组为:正常对照组，1mmol/LAlCl3组，空质粒组，CHIP质粒转染组，CHIP质粒转染+1mmol/LAlCl3组；二是观察CHIP干扰对染铝细胞tau蛋白的影响：正常对照组，1mmol/LAlCl3组，CHIPshRNA阴性对照组，CHIPshRNA组，CHIPshRNA+1mmol/LAlCl3组；
2.选择细胞系同上，对细胞进行1mmol/LAlCl3染毒及CHIP不同结构域质粒转染，实验分为两部分：一是观察CHIP(ΔU-box)在CHIP调控铝致tau蛋白异常磷酸化中的作用，实验分组为：正常对照组，1mmol/LAlCl3组，空质粒组，CHIP(ΔU-box)质粒转染组，CHIP(ΔU-box)+1mmol/LAlCl3组；二是观察CHIP(ΔTPR)在CHIP调控铝致tau蛋白异常磷酸化中的作用，实验分组为：正常对照组，1mmol/LAlCl3组，空质粒组，CHIP(ΔTPR)质粒转染组，CHIP(ΔTPR)+1mmol/LAlCl3组。
上述处理结束后，收集细胞并提取总蛋白样品，采用Westernblot的方法分别检测tau-5，pThr181，pThr231，pSer262，pSer396，CHIP，Hsp70及Ub的蛋白表达水平，通过免疫共沉淀的方法检测CHIP与tau-5，pThr181，pThr231，pSer262，pSer396，Hsp70及Ub的相互作用。
结果：
1.N2a细胞CHIP过表达
1.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝可引起CHIP，Ub，pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著增高(P＜0.05)；CHIP过表达引起CHIP和Ub蛋白表达水平显著增高(P＜0.05)，pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。经析因分析显示，在N2a细胞中CHIP过表达与AlCl3染毒在CHIP，Ub和pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
1.2免疫共沉淀结果显示：利用anti-CHIP进行IP所得免疫沉淀复合物用WB检测到Hsp70，Ub与tau蛋白pThr231，pSer262，pSer396磷酸化位点，说明CHIP与Hsp70，Ub,tau蛋白及其各磷酸化位点之间存在相互作用。
2.N2a细胞CHIP干扰
2.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝可引起CHIP，Ub和pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)；CHIP干扰引起CHIP和Ub蛋白表达显著降低(P＜0.05)，pThr231，pSer262，pSer396表达均有明显升高(P＜0.05)。经析因分析显示，在N2a细胞中CHIP干扰与AlCl3染毒在CHIP，Ub和pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
3.N2a细胞CHIP(U-box)结构域质粒转染
3.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝引起CHIP，Ub和pThr31231，pSer262，pSer396蛋白表达均显著升高(P＜0.05)；CHIP(ΔU-box)结构域转染引起pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。经析因分析结果显示，CHIP(ΔU-box)结构域转染和染铝在CHIP和Ub的蛋白表达变化中不存在交互作用，而在pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
3.2免疫共沉淀结果显示:利用anti-Myc进行IP，得到的免疫沉淀复合物用WB在CHIP(ΔU-box)转染组和CHIP(ΔU-box)+1mmol/LAlCl3组中未检测到Hsp70，Ub以及tau蛋白pThr231，pSer262，pSer396各磷酸化位点与CHIP之间的相互作用。在各组免疫沉淀复合物中均能检测到Myc-CHIP。
4.N2a细胞CHIP(TPR)结构域质粒转染
4.1免疫印记结果显示：与对照组相比，染铝引起1mmol/LAlCl3组CHIP，Ub，pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)；CHIP(ΔTPR)结构域转染引起pThr231，pSer262，pSer396表达显著升高(P＜0.05)。经析因分析结果显示，CHIP(ΔTPR)结构域转染和染铝在CHIP和Ub的蛋白表达变化中不存在交互作用，而在pThr231，pSer262，pSer396蛋白表达变化中存在交互作用。
4.2免疫共沉淀结果显示:利用anti-Myc进行IP所得免疫沉淀复合物用WB检测到Hsp70，Ub与CHIP存在相互作用。在CHIP(ΔTPR)质粒转染组、CHIP(ΔTPR)+1mmol/LAlCl3组中检测到myc-CHIP；在CHIP(ΔTPR)质粒转染组、CHIP(ΔTPR)+1mmol/LAlCl3组中未检测到pThr231，pSer262，pSer396与CHIP之间相互作用。
结论：
1.CHIP参与了铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化的调控，且主要调控位点是pThr231、pSer262、pSer396位点。
2.CHIP不同结构域在铝致N2a细胞tau蛋白异常磷酸化的调控过程中各自发挥了重要作用，二者必须共同存在发挥作用，缺一不可。