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研究目的近年来研究表明,作为竞争性内源RNA(ceRNA)调节关键基因的表达,是长链非编码RNA(lncRNA)参与调控肿瘤发生发展的重要机制。假基因表达的转录产物是lncRNA家族的一个重要亚型。PTENP1是PTEN的假基因,在多种恶性肿瘤中已证明通过调控PTEN的表达发挥抑癌作用,然而PTENP1在胃癌中的表达和生物学功能尚不明确。本课题组前期工作已证实,PTENP1与PTEN在胃癌组织中均表达下调且呈明显的正相关性,表明二者之间可能存在有意义的调控作用。本研究旨在通过细胞实验和分子生物学方法,揭示并阐明PTENP1作为ceRNA,通过竞争性结合miR-106b和miR-93来实现对PTEN的调控作用,从而在胃癌细胞中发挥重要的抑癌作用,证明PTENP1:miR-106b/miR-93:PTEN这一ceRNA调控网络在胃癌细胞中存在并发挥重要的功能。研究方法1、采用qRT-PCR比较PTENP1在人胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MGC803、BGC823)和正常人胃粘膜上皮细胞GES-1中的表达情况。采用慢病毒感染的方法构建稳定过表达PTENP1的胃癌细胞株(Lenti-PTENP1),分别通过qRT-PCR和western blot检测PTEN mRNA和蛋白的表达情况。2、利用已获得的稳定过表达PTENP1的胃癌细胞株,采用MTT法观察PTENP1过表达对胃癌细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法研究细胞凋亡能力的改变,Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力的变化。3、利用Microcosm Targets、TargetScan以及miRanda等生物信息学软件分析PTEN与miR-106b~25基因簇(miR-106b、miR-25和miR-93)的可能结合位点,经Clustal Omega序列比对分析证明此结合位点在PTENP1基因序列上是否存在。通过双荧光素酶基因检测验证miR-106b和miR-93对PTENP1的靶向结合作用。4、构建共表达细胞系进行浓度梯度实验,即梯度增加含PTENP1野生型或突变型载体质粒(pCDH-PTENP1或pCDH-mutPTENP1)的浓度,与定量的miR-106b或miR-93 mimics进行共转染胃癌细胞MGC803和BGC823,通过qRT-PCR检测PTEN mRNA表达水平的改变,验证PTENP1是否通过竞争性结合miR-106b和mi R-93来实现对PTEN表达的调控作用,证明PTENP1:miR-106b/miR-93:PTEN ceRNA网络在胃癌细胞中存在。研究结果1、PTENP1在胃癌细胞MGC803和BGC823中的表达水平显著低于在正常人胃粘膜上皮细胞GES-1中的表达,我们选择这两种细胞系作为进一步研究的实验对象。在体外用慢病毒感染MGC 803和BGC 823细胞来构建稳定过表达PTENP1的胃癌细胞株,通过qRT-PCR和western blot检测发现,相较于感染空载质粒组细胞(Lenti-NC),PTEN mRNA和蛋白的表达量均明显增加。2、使胃癌细胞过表达PTENP1后,MTT实验发现细胞增殖能力下降,同时Annexin V/PI双染法证实PTENP1过表达可促进胃癌细胞的早期和晚期凋亡事件,细胞的凋亡率增加。进一步进行Transwell实验,结果表明,同课题组前期研究得到的胃癌组织中PTENP1的表达量与淋巴结转移相关的结果一致,PTENP1过表达抑制胃癌细胞迁移和侵袭。3、经生物信息学分析和基因序列比对,提示PTENP1可能是miR-106b和miR-93的靶基因,与mi R-25无直接的靶向结合关系。双荧光素酶报告基因检测结果显示:miR-106b和miR-93能够明显降低含PTENP1野生型3’UTR载体的荧光素酶活性,而对含突变型3’UTR载体无影响。4、浓度梯度实验显示,PTEN mRNA的表达水平随PTENP1野生型载体质粒(pCDH-PTENP1)浓度的增加而增加,呈现出线性剂量依赖,而梯度增加PTENP1突变型载体质粒(pCDH-mutPTENP1)的浓度,PTEN mRNA的表达量无明显变化。研究结论1、胃癌细胞过表达PTENP1后,PTEN mRNA和蛋白的表达量均增加,且细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降,凋亡增加,提示在胃癌细胞中,PTENP1通过调控PTEN的表达发挥抑癌作用。2、双荧光素酶报告基因检测和浓度梯度实验表明PTENP1通过竞争性结合miR-106b和miR-93来调控PTEN的表达,证实PTENP1:miR-106b/miR-93:PTEN这一ceRNA调控网络在胃癌细胞中存在。3、通过细胞实验和分子生物学方法证实lncRNA PTENP1作为ceRNA通过PTENP1:miR-106b/miR-93:PTEN调控网络在胃癌细胞中发挥重要的抑癌作用。