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乙醇脱氢酶(ADH)催化乙醛和乙醇之间的可逆反应,不仅直接参与催化乙醇的产生和利用,而且参与维持胞内辅因子平衡,在酵母糖代谢过程中具有至关重要的作用。本论文以天然木糖发酵酵母麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)为研究材料,从基因克隆、酶学性质、基因表达、生理功能和基因进化等几个层面上研究并阐述了该菌的.ADH系统,首次揭示了天然木糖发酵酵母中ADH基因的功能分化和葡萄糖调控作用。
首先,我们利用同源克隆和染色体步移法,克隆到C.maltosa Xu316的三个细胞质ADH基因(CmADH1、CmADH2A和CmADH2B),有意思的是CmADH2A和CmADH2B串联相邻。原核表达重组蛋白的体外酶学性质分析表明,这三个ADH均为NAD+辅因子专一性,对乙醇以外的其他多种醇也具有催化活性。ADH同工酶酶谱分析显示出CmADH1和CmADH2A的同源和异源四聚体形式。C.maltosa产生多种ADH同工酶,呈现5条清晰的ADH活性带。迁移最快和最慢的ADH条带分别是CmADH1和CmADH2A编码的同源四聚体,另外三条带则是由这两个基因所编码的肽链按不同比例(1:3、2:2和3:1)形成的异源四聚体。
接着,利用ADH同工酶酶谱分析,检测了不同碳源、生长阶段和通氧条件对C.maltosa ADH同工酶蛋白表达的影响。结果表明,葡萄糖诱导CmADH1的表达,抑制CmADH2A的表达:乙醇可能抑制CmADH1的表达,但此抑制会因葡萄糖的存在而消除,而CmADH2A在乙醇为唯一碳源培养时大量表达。在葡萄糖培养时,CmADH1在指数生长期开始逐渐表达,而CmADH2A在指数生长期后期当葡萄糖耗尽后才开始表达；相比之下,在木糖培养时,CmADH2A的表达在指数生长初期就己开始,远早于葡萄糖培养时的情况。当细胞从通氧培养换成限氧培养时,CmADH1的蛋白表达量升高,而CmADH2A的蛋白表达量降低。因此,在葡萄糖代谢过程中,CmADH1负责乙醇的产生,而CmADH2A负责同化所积累的乙醇；在木糖代谢过程中,CmADH2A可能参与乙醇的产生；CmADH2B可能在正常的生理条件下表达量很低或并不表达,其具体功能尚不明确。
为了进一步考察CmADH2A在糖代谢中的功能,利用丙烯醇作为筛选物质筛选到C.maltosa ADH2A缺陷的自然突变株。发酵试验表明,ADH2A的缺陷对葡萄糖代谢影响不大；但造成细胞利用木糖产乙醇量的减少和甘油的积累,并且导致在限氧条件下木糖醇产量的降低,另外,突变株在限氧时比在通氧时积累更多的甘油。这些结果表明,在葡萄糖代谢过程中,CmADH2A基本不参与乙醇的产生:但在木糖代谢过程中,CmADH1和CmADH2A共同负责乙醇的产生,其作用主要是为了再生NAD+,从而维持细胞内NADH/NAD+的比值以利于木糖醇的积累。
最后,通过酵母ADH的同源蛋白系统树分析和所在区域的基因组结构的比较,丰富了已报道的酵母ADH进化模型。该模型揭示了在C.maltosa与其他CTG分支酵母发生分化之前,C.maltosa的ADH1和ADH2A相应的基因座就已经存在于它们共同的祖先酵母中:C.maltosa在其演化过程中独立发生了一次串联ADH基因倍增,形成了现在串联相邻的CmADH2A和CmADH2B。另外,C.maltosa在葡萄糖发酵过程中表现Crabtree效应,即能在有氧条件下发酵葡萄糖产生大量乙醇,该发酵行为类似于Saccharomyces cerevisiae。同时,C.maltosa在通氧条件下要比在限氧条件下利用木糖产生更多的乙醇,这不同于限氧条件促进Pichia stipitis利用木糖产乙醇的情况。
综上所述,通过对C.maltosa乙醇脱氢酶系统的研究,我们发现该菌具有成为优良的乙醇生产菌种的潜力。C.maltosa既可以利用木糖,又能发酵葡萄糖积累大量乙醇,可以作为研究酵母葡萄糖和木糖代谢途径和调控网络的一个很好的实验材料。