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粘帚霉(Gliocladium spp.)是一类分布广泛的土壤习居菌,也是目前已知的颇具应用前景的植物生防因子之一。粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)67-1菌株是由中国农业科学院植物保所土传病害实验室分离筛选得到的一株高效植病生防菌株,对多种植物病原菌都具有很强的寄生能力。然而,从自然土壤中分离筛选的野生菌株往往由于生长速率、产孢量、寄生能力和抗逆性等原因,限制了生防菌株抗病能力的提高,从而影响了田间实际应用效果和商品化生产,为使生防菌株的生防效果得到提高,就要对菌株进行遗传改良以及外源的功能基因转化。
本论文研究了粉红粘帚霉67-1菌株原生质体转化方法,采用限制性内切酶介导的PEG转化法将含有潮霉素抗性基因(hph)的质粒pAN7-1转入粉红粘帚霉67-1基因组中,确定了转化条件,即线性化质粒与40％的PEG3350混合,加入1 μ1的10u/μ1限制性内切酶HindⅢ,室温转化10min。混合液于再生培养基上复苏24h,覆盖300 μ g/ml潮霉素抗性PDA板筛选,转化效率达到40-50个转化子/μu g质粒DNA。获得的转化子在连续传接3代后仍具有遗传稳定性,经PCR、Real-time PCR、Southern杂交检测证明,hph基因已经整合到转化子基因组中。
运用该转化体系,将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)内切几丁质酶基因ThEn42导入粉红粘帚霉67-1中。酶学和分子生物学研究表明,转入几丁质酶基因能够有效提高粉红粘帚霉67-1菌株几丁质酶表达水平,20％的转化子几丁质酶活性显著提高。通过Real-time PCR方法检测转化子与野生型菌株ThEn42基因在转录水平上的差异,其中转化子PL1转录水平是野生型的6倍。30％的转化子的代谢产物对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)抑制效果显著增强,但对峙培养中,转化子与野生型菌株对核盘菌的拮抗作用无显著差异。生防菌株是否能够通过提高几丁质酶表达量增强温室及田间防病效果,还需要进一步试验验证。