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目的：
研究SIRPα通过miR-106a相关ceRNA网络调控自噬相关基因ATGs(ATG16L1、ATG7、ULK-1)的表达,进而影响巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬反应的分子机制.
方法：
1.通过qRT-PCR检测将H37Ra以不同感染复数或不同感染时间感染THP-1源性巨噬细胞,其miR-106a、SIRPα和ATGs的表达量.
2.对高通量基因表达数据库进行检索,运用生物信息学分析软件分析获得miR-106a对自噬相关基因ATG16L1、ATG7、ULK-1以及炎症通路相关基因SIRPα的靶向调控作用,通过miRbase、mirSVR、miRTarBase等对其结合部分序列进行比对分析,构建双荧光素酶报告实验的质粒,分别将野生型SIRPα3UTR、ATG16L13UTR、ATG73UTR和ULK-13UTR及其突变体克隆到pMIR-GLO质粒中,利用双荧光素酶报告系统和Western blot,验证miR-106a对SIRPα、ATG16L1、ATG7和ULK-1的靶向调控作用,并利用双荧光素酶实验论证SIRPα-3UTR/miR-106a/ATGs ceRNA网络.
3.构建H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞模型,将miR-106a mimic、miR-106a inhibitor、miR-106a nc分别转染到THP-1细胞中,通过免疫荧光、透射电镜、Western blot实现对自噬流的检测,通过自噬小体分布状况及自噬相关蛋白表达水平的改变,研究miR-106a对自噬过程的调控作用.
4.将SIRPα3UTR克隆到pEGFP-C1质粒中构建pEGFP-SIRPα,分别将pEGFP-C1+miR-106a mimic,pEGFP-C1+miR-106a mimic nc,pEGFP-SIRPα+miR-106a mimic,pEGFP-SIRPα+miR-106a mimic nc四组质粒共转染进入之前构建成功H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞模型中,通过免疫荧光、透射电镜、Western blot实现对自噬流的检测,通过自噬小体分布状况及自噬相关蛋白表达水平的改变,研究SIRPα对自噬过程的调控作用.
结果：
1.在H37Ra感染的情况下,qRT-PCR结果显示与未感染组相比SIRPα基因的表达量明显降低,miR-106a的表达量也呈现下调的趋势(P<0.05),而ATGs的表达量都呈现明显的上调,其中ULK-1的上调程度最为显著(P<0.0001).
2.通过生物信息学分析得到的miR-106a和SIRPα、ATGs(ATG16L1、ATG7、ULK-1)这些基因都具有靶向关系.利用双荧光素酶报告系统进行验证,转染miR-106a mimic可明显抑制SIRPαwt、ATGs wt的相对荧光素酶活性,其活性下降约1倍(P<0.05).再通过Western blot证实miR-106a mimic相较于nc组能明显抑制SIRPα、ATGs蛋白的表达,而miR-106a inhibitor组SIRPα、ATGs蛋白表达量明显升高,结果表明miR-106a与SIRPα、ATGs具有靶向性.而且进一步也通过双荧光素酶实验论证了SIRPα/miR-106a/ATGs ceRNA网络的存在.
3.为了论证miR-106a对自噬流的影响,首先通过Western blot实验,结果显示转染miR-106a mimic组中自噬相关蛋白ATGs的表达下降,LC3-Ⅱ表达量明显减少,LC3Ⅱ/LC3I比值降低.其次细胞免疫荧光中miR-106a mimic组相较于nc组LC3点状聚集的数量也是减少的,再通过透射电镜对自噬小体结构进行观察并计数统计,证实自噬小体的数量降低,而miR-106a inhibitor组结果正好相反.结果表明,miR-106a可以通过靶向抑制ATG16L1、ATG7和ULK-1的表达抑制H37Ra介导的细胞自噬过程.
4.为了研究SIRPα对自噬流的影响,Western blot实验结果显示pEGFP-SIRPα组与pEGFP-C1组相比ATGs的表达升高,LC3-Ⅱ表达量增加,将miR-106a mimic+pEGFP-C1组与miR-106a mimic+pEGFP-SIRPα组相比较,发现上调表达SIRPα-3UTR能够抵消或降低miR-106a mimic对自噬的调控作用.最后通过细胞免疫荧光和透射电镜实验也证实了SIRPα能够促进自噬的作用,表明SIRPα能够通过ceRNA网络竞争miRNA-106a促进细胞自噬.
结论：
1.H37Ra感染巨噬细胞能够引起SIRPα、miRNA-106a以及ATGs的表达量的改变.
2.miR-106a可靶向结合ATGs、SIRPα基因,并证实SIRPα/miRNA-106a/ATGs之间ceRNA网络的存在.
3.miR-106a可通过靶向ATGs调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬反应.
4.SIRPα可通过ceRNA网络竞争miRNA-106a调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬反应,从而实现促进细胞自噬的作用.
研究SIRPα通过miR-106a相关ceRNA网络调控自噬相关基因ATGs(ATG16L1、ATG7、ULK-1)的表达,进而影响巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬反应的分子机制.
方法：
1.通过qRT-PCR检测将H37Ra以不同感染复数或不同感染时间感染THP-1源性巨噬细胞,其miR-106a、SIRPα和ATGs的表达量.
2.对高通量基因表达数据库进行检索,运用生物信息学分析软件分析获得miR-106a对自噬相关基因ATG16L1、ATG7、ULK-1以及炎症通路相关基因SIRPα的靶向调控作用,通过miRbase、mirSVR、miRTarBase等对其结合部分序列进行比对分析,构建双荧光素酶报告实验的质粒,分别将野生型SIRPα3UTR、ATG16L13UTR、ATG73UTR和ULK-13UTR及其突变体克隆到pMIR-GLO质粒中,利用双荧光素酶报告系统和Western blot,验证miR-106a对SIRPα、ATG16L1、ATG7和ULK-1的靶向调控作用,并利用双荧光素酶实验论证SIRPα-3UTR/miR-106a/ATGs ceRNA网络.
3.构建H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞模型,将miR-106a mimic、miR-106a inhibitor、miR-106a nc分别转染到THP-1细胞中,通过免疫荧光、透射电镜、Western blot实现对自噬流的检测,通过自噬小体分布状况及自噬相关蛋白表达水平的改变,研究miR-106a对自噬过程的调控作用.
4.将SIRPα3UTR克隆到pEGFP-C1质粒中构建pEGFP-SIRPα,分别将pEGFP-C1+miR-106a mimic,pEGFP-C1+miR-106a mimic nc,pEGFP-SIRPα+miR-106a mimic,pEGFP-SIRPα+miR-106a mimic nc四组质粒共转染进入之前构建成功H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞模型中,通过免疫荧光、透射电镜、Western blot实现对自噬流的检测,通过自噬小体分布状况及自噬相关蛋白表达水平的改变,研究SIRPα对自噬过程的调控作用.
结果：
1.在H37Ra感染的情况下,qRT-PCR结果显示与未感染组相比SIRPα基因的表达量明显降低,miR-106a的表达量也呈现下调的趋势(P<0.05),而ATGs的表达量都呈现明显的上调,其中ULK-1的上调程度最为显著(P<0.0001).
2.通过生物信息学分析得到的miR-106a和SIRPα、ATGs(ATG16L1、ATG7、ULK-1)这些基因都具有靶向关系.利用双荧光素酶报告系统进行验证,转染miR-106a mimic可明显抑制SIRPαwt、ATGs wt的相对荧光素酶活性,其活性下降约1倍(P<0.05).再通过Western blot证实miR-106a mimic相较于nc组能明显抑制SIRPα、ATGs蛋白的表达,而miR-106a inhibitor组SIRPα、ATGs蛋白表达量明显升高,结果表明miR-106a与SIRPα、ATGs具有靶向性.而且进一步也通过双荧光素酶实验论证了SIRPα/miR-106a/ATGs ceRNA网络的存在.
3.为了论证miR-106a对自噬流的影响,首先通过Western blot实验,结果显示转染miR-106a mimic组中自噬相关蛋白ATGs的表达下降,LC3-Ⅱ表达量明显减少,LC3Ⅱ/LC3I比值降低.其次细胞免疫荧光中miR-106a mimic组相较于nc组LC3点状聚集的数量也是减少的,再通过透射电镜对自噬小体结构进行观察并计数统计,证实自噬小体的数量降低,而miR-106a inhibitor组结果正好相反.结果表明,miR-106a可以通过靶向抑制ATG16L1、ATG7和ULK-1的表达抑制H37Ra介导的细胞自噬过程.
4.为了研究SIRPα对自噬流的影响,Western blot实验结果显示pEGFP-SIRPα组与pEGFP-C1组相比ATGs的表达升高,LC3-Ⅱ表达量增加,将miR-106a mimic+pEGFP-C1组与miR-106a mimic+pEGFP-SIRPα组相比较,发现上调表达SIRPα-3UTR能够抵消或降低miR-106a mimic对自噬的调控作用.最后通过细胞免疫荧光和透射电镜实验也证实了SIRPα能够促进自噬的作用,表明SIRPα能够通过ceRNA网络竞争miRNA-106a促进细胞自噬.
结论：
1.H37Ra感染巨噬细胞能够引起SIRPα、miRNA-106a以及ATGs的表达量的改变.
2.miR-106a可靶向结合ATGs、SIRPα基因,并证实SIRPα/miRNA-106a/ATGs之间ceRNA网络的存在.
3.miR-106a可通过靶向ATGs调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬反应.
4.SIRPα可通过ceRNA网络竞争miRNA-106a调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌自噬反应,从而实现促进细胞自噬的作用.