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研究目的：1）制备脐带间充质干细胞并观察其多项分化潜能。2）制备氧化石墨烯固体颗粒并对其进行检测分析。3）制备氧化石墨烯颗粒润滑剂并观察氧化石墨烯与脐带间充质干细胞的体外生物相容性。4）通过两种不同方法建立膝关节骨性关节炎动物模型。5）利用制备的氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载制备的脐带间充质干细胞联合中药淫羊藿治疗两种膝骨关节炎动物模型，比较分析其效果的差异。
研究方法：1）从脐带组织中分离、培养间充质干细胞，观察传代的细胞形态及生长方式等情况，取P5代细胞进行生物学特性检测，包括三阳性抗体、五阴性抗体、细菌内毒素及支原体检测等。取P5代细胞进行成骨、成软骨以及成脂肪的分化能力检测，评估制备的脐带间充质干细胞的分化潜能。2）采用Hummers法将天然石墨鳞片制备成为氧化石墨烯颗粒，并对其进行显微镜下结构、红外光谱及X线衍射的分析评价。3）将制备的氧化石墨烯颗粒研磨成粉末并与玻璃酸钠注射液超声振荡下混匀；将氧化石墨烯颗粒和氧化石墨烯颗粒润滑剂与脐带间充质干细胞进行离体共培养，观察其生物相容性，并观察不同浓度之间的氧化石墨烯颗粒与脐带间充质干细胞的培养情况。4）利用改良Hulth联合软骨缺损的手术造模方法与改良的木瓜蛋白酶控释剂关节注射方法制备两种膝骨性关节炎动物兔模型并进行Micro-CT、Ⅱ型胶原染色及血清一氧化氮分析。5）分别建立两种不同膝骨性关节炎动物模型各19只，其中空白对照组各3只，治疗试验组各16只；其中试验组根据干预方法的不同分4组，氧化石墨烯颗粒润滑剂组各4只、脐带间充质干细胞组各4只、氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载脐带间充质干细胞组各4只、氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载脐带间充质干细胞联合中药内服组各4只，两组共计38只。其中，氧化石墨烯及脐带间充质干细胞通过关节腔注射治疗，均为1次。淫羊藿中药灌胃1次/d，共治疗28d，在关节腔注射治疗时同步开始。手术造模后1个月开始治疗，治疗观察期8周，关节注射造模后1周开始治疗，治疗观察期8周。比较治疗前后的软骨一般形态、血清及关节液中IL-6、TNF-α、NO、GAG以及COL-Ⅱ的表达水平，分析不同治疗方法对两种模型的疗效。
研究结果：1）分离培养的脐带间充质干细胞贴壁生长，细胞呈梭形，类成纤维细胞样，呈漩涡状排列、簇状生长；细胞的大小均匀,生长情况良好，细胞活率为98%，支原体与内毒素检测均为阴性；P5代细胞的三阳性抗体表达呈阳性，五阴性抗体表达呈阴性，且具有成骨、成软骨及成脂肪的分化潜能。2）实验制备的氧化石墨烯颗粒具有褶皱型片层结构，质地透明，氧化后生成亲水性的羟基、羰基和羧基官能团以及疏水性的环氧基官能团，在GO的X线衍射曲线图结果中可以清晰地发现，在2θ=10.69°处产生强烈的特征峰，是GO经超声剥后其片层间距变大的结果。3）30ug/ml的低浓度氧化石墨烯颗粒对脐带间充质干细胞的吸附、促进作用更加明显，而0.25％的低浓度HA混合浓度更有利于氧化石墨烯颗粒的均匀分布，而8×104的脐带细胞浓度更有利于氧化石墨烯支架作用的体现。4）改良Hulth+软骨缺损法建立的膝骨关节炎模型造模4周后Micro-CT可见明显软骨缺损区，并且软骨下骨出现破坏，同时血清一氧化氮水平均有一定程度升高；改良木瓜蛋白酶控释剂关节腔注射造模1周后Micro-CT可见软骨层变薄且不均匀规则，而软骨下骨则正常，血清的一氧化氮水平较A组升高更为明显。A组的Ⅱ型胶原蛋白染色基本不表达，B组则表达程度降低且不均匀。5）中药联合组的两种模型可见软骨缺损基本修复，GO颗粒润滑剂对关节软骨及关节腔内环境没有明显改善作用，UCMSC具有一定程度的修复及改善炎症作用。IL-6A、TNF-α、NO以及软骨细胞分泌的GAG、COL-Ⅱ治疗结果A组中以GO+MSC组的治疗效果最好，B组则是联合中药的效果最好，但血清与关节液的炎性因子改善结果并不统一，IL-6A、TNF-α、NO的差异性更大。
研究结论：1)实验所分离取得的脐带间充质干细胞生长情况良好，细胞形态、生物学检测及体外定向分化能力检测均符合国际标准，可以用于进一步实验研究。2)实验采用Hummers法将天然石墨制备成为GO纳米材料，并且经电镜、红外光谱及X射线等检测后符合标准，可以用于后续实验。3)GO可以和UCMSC在体外共存，并且有吸附、促进的作用。低浓度的GO与足够浓度的UCMSC是有利于细胞存活、增殖的最佳条件，并且低浓度的HA有利于UCMSC+GO的均匀分布。4)改良后的Hulth软骨缺损模型和改良后的木瓜蛋白酶控释剂模型均符合各自支持的KOA模型理论，适合为后续实验研究所采用。5)氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载脐带间充质干细胞可以很好地促进软骨修复并改善关节内生化水平，联合中药淫羊藿内服对于软骨缺损KOA模型的治疗有一定的抑制作用，对于软骨退变KOA模型则可以促进治疗效果。
研究方法：1）从脐带组织中分离、培养间充质干细胞，观察传代的细胞形态及生长方式等情况，取P5代细胞进行生物学特性检测，包括三阳性抗体、五阴性抗体、细菌内毒素及支原体检测等。取P5代细胞进行成骨、成软骨以及成脂肪的分化能力检测，评估制备的脐带间充质干细胞的分化潜能。2）采用Hummers法将天然石墨鳞片制备成为氧化石墨烯颗粒，并对其进行显微镜下结构、红外光谱及X线衍射的分析评价。3）将制备的氧化石墨烯颗粒研磨成粉末并与玻璃酸钠注射液超声振荡下混匀；将氧化石墨烯颗粒和氧化石墨烯颗粒润滑剂与脐带间充质干细胞进行离体共培养，观察其生物相容性，并观察不同浓度之间的氧化石墨烯颗粒与脐带间充质干细胞的培养情况。4）利用改良Hulth联合软骨缺损的手术造模方法与改良的木瓜蛋白酶控释剂关节注射方法制备两种膝骨性关节炎动物兔模型并进行Micro-CT、Ⅱ型胶原染色及血清一氧化氮分析。5）分别建立两种不同膝骨性关节炎动物模型各19只，其中空白对照组各3只，治疗试验组各16只；其中试验组根据干预方法的不同分4组，氧化石墨烯颗粒润滑剂组各4只、脐带间充质干细胞组各4只、氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载脐带间充质干细胞组各4只、氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载脐带间充质干细胞联合中药内服组各4只，两组共计38只。其中，氧化石墨烯及脐带间充质干细胞通过关节腔注射治疗，均为1次。淫羊藿中药灌胃1次/d，共治疗28d，在关节腔注射治疗时同步开始。手术造模后1个月开始治疗，治疗观察期8周，关节注射造模后1周开始治疗，治疗观察期8周。比较治疗前后的软骨一般形态、血清及关节液中IL-6、TNF-α、NO、GAG以及COL-Ⅱ的表达水平，分析不同治疗方法对两种模型的疗效。
研究结果：1）分离培养的脐带间充质干细胞贴壁生长，细胞呈梭形，类成纤维细胞样，呈漩涡状排列、簇状生长；细胞的大小均匀,生长情况良好，细胞活率为98%，支原体与内毒素检测均为阴性；P5代细胞的三阳性抗体表达呈阳性，五阴性抗体表达呈阴性，且具有成骨、成软骨及成脂肪的分化潜能。2）实验制备的氧化石墨烯颗粒具有褶皱型片层结构，质地透明，氧化后生成亲水性的羟基、羰基和羧基官能团以及疏水性的环氧基官能团，在GO的X线衍射曲线图结果中可以清晰地发现，在2θ=10.69°处产生强烈的特征峰，是GO经超声剥后其片层间距变大的结果。3）30ug/ml的低浓度氧化石墨烯颗粒对脐带间充质干细胞的吸附、促进作用更加明显，而0.25％的低浓度HA混合浓度更有利于氧化石墨烯颗粒的均匀分布，而8×104的脐带细胞浓度更有利于氧化石墨烯支架作用的体现。4）改良Hulth+软骨缺损法建立的膝骨关节炎模型造模4周后Micro-CT可见明显软骨缺损区，并且软骨下骨出现破坏，同时血清一氧化氮水平均有一定程度升高；改良木瓜蛋白酶控释剂关节腔注射造模1周后Micro-CT可见软骨层变薄且不均匀规则，而软骨下骨则正常，血清的一氧化氮水平较A组升高更为明显。A组的Ⅱ型胶原蛋白染色基本不表达，B组则表达程度降低且不均匀。5）中药联合组的两种模型可见软骨缺损基本修复，GO颗粒润滑剂对关节软骨及关节腔内环境没有明显改善作用，UCMSC具有一定程度的修复及改善炎症作用。IL-6A、TNF-α、NO以及软骨细胞分泌的GAG、COL-Ⅱ治疗结果A组中以GO+MSC组的治疗效果最好，B组则是联合中药的效果最好，但血清与关节液的炎性因子改善结果并不统一，IL-6A、TNF-α、NO的差异性更大。
研究结论：1)实验所分离取得的脐带间充质干细胞生长情况良好，细胞形态、生物学检测及体外定向分化能力检测均符合国际标准，可以用于进一步实验研究。2)实验采用Hummers法将天然石墨制备成为GO纳米材料，并且经电镜、红外光谱及X射线等检测后符合标准，可以用于后续实验。3)GO可以和UCMSC在体外共存，并且有吸附、促进的作用。低浓度的GO与足够浓度的UCMSC是有利于细胞存活、增殖的最佳条件，并且低浓度的HA有利于UCMSC+GO的均匀分布。4)改良后的Hulth软骨缺损模型和改良后的木瓜蛋白酶控释剂模型均符合各自支持的KOA模型理论，适合为后续实验研究所采用。5)氧化石墨烯颗粒润滑剂搭载脐带间充质干细胞可以很好地促进软骨修复并改善关节内生化水平，联合中药淫羊藿内服对于软骨缺损KOA模型的治疗有一定的抑制作用，对于软骨退变KOA模型则可以促进治疗效果。