【摘 要】
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目的：利用自身淬灭探针技术建立一种能广泛应用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉和稳定性较好的新型结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。 方法：采用基因克隆技术，将结核分
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目的：利用自身淬灭探针技术建立一种能广泛应用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉和稳定性较好的新型结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。 方法：采用基因克隆技术，将结核分枝杆菌16s rRNA基因片段插入到载体 PET-32a(+)中，获得含有16s rRNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据结核分枝杆菌16s rRNA的基因片段编码基因序列设计合成自身淬灭引物，优化PCR条件，建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法，并对所建立的方法进行方法学评价。最后用该方法对临床收集的疑为结核分枝杆菌感染的患者标本进行检测并和培养方法进行比较。 结果：⑴成功构建了重组质粒 PET-32a(+)-16s rRNA。⑵建立了以自身淬灭探针技术为基础的检测结核分枝杆菌的实时荧光定量 PCR方法，其线性范围为102~109copies/ul；灵敏度为1 copies/ul；高拷贝样品的天间CV为2.65%、批内CV为1.86%，低拷贝样品的天间CV为2.12%、批内CV为0.78%；特异性好。⑶通过初步临床应用发现，所建立的FQ-PCR方法与经典的培养方法相比，不仅能实时监测反应进程、绝对定量和快速检测，而且对标本采集的要求明显低于培养法，不受细菌的死活、变异、细菌L型等因素的影响。FQ-PCR敏感性100%（28/28），高于培养法71.4%（20/28），两者特异性均为100%（19/19）。 结论：在国内外首次应用自身淬灭引物（探针）技术建立了结核分枝杆菌新型荧光定量PCR检测方法，为结核分枝杆菌新型荧光定量PCR检测试剂盒的研发和规模化生产奠定了坚实的基础，同时也对应用自身淬灭引物（探针）技术开发其他病原体检测试剂盒起到一定能够的参考作用。
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