论文部分内容阅读
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)广泛存在于人体多种组织中，是一类可自我复制及定向分化的多能干细胞。随着研究的逐步深入，MSCs独特的免疫调节特性引起了人们的广泛关注。大量研究发现MSCs可定向趋化至损伤部分，在IFN-γ和TNF-α等炎症因子的赋能下，缓解炎症，促进损伤修复。因此，MSCs被尝试应用于多种炎症性疾病的治疗研究中，临床应用潜力巨大。然而，近年来关于其疗效不稳定性的报道使得人们开始重新审视MSCs在炎症环境中的免疫调节作用。我们在前期研究中发现，多种炎症因子及免疫抑制类药物可促进或消除MSCs免疫抑制作用，即MSCs的免疫调节的“可塑性”。其中，糖皮质激素(Glucocorticoids，GCs)类免疫抑制剂已被发现在临床肝硬化、移植物抗宿主病(graft-versus-host diseas，GvHD)，以及自身免疫性肠炎（inflammatory blow disease，IBD）的治疗中干扰MSCs的免疫调节作用，影响MSCs的疗效发挥，但相关机制尚不明确。基于上述研究基础，本研究旨在关注GCs与MSCs在疾病治疗中的相互作用，明确GCs调控MSCs免疫调节作用的分子学机制，形成MSCs治疗疾病的优化新策略。 现已明确，GCs类药物地塞米松(Dexamenthasone，Dex)和MSCs对移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD）分别有良好疗效。值得注意的是，我们在GvHD小鼠中同时输注Dex以及MSCs，两者的免疫抑制作用被阻断，反而加剧了免疫反应，促进GvHD病程。在体外也有类似的现象:在MSCs与淋巴细胞体外共培养体系中引入Dex明显促进了T淋巴细胞增殖。此外，我们证明Dex调控MSCs介导的免疫促进主要作用于CD8+T细胞而非CD4+T细胞。通过基因芯片详细分析共培养体系中加入Dex前后MSCs的基因表达变化，我们注意到血管内皮细胞生长因子C(Vascular Endothelial Growth Factor C，VEGFC)，一种分泌型细胞生长因子，表达有了显著提高。进一步对VEGFC的功能验证显示，在混合淋巴细胞反应体系及anti-CD3/28激活的CD8+T细胞增殖体系内，VEGFC能剂量依赖性地提高CD8+T淋巴细胞增殖水平。同时，VEGFC对应的受体VEGFR3的酪氨酸激酶抑制剂MAZ51可特意性阻断这种促进作用。此外，条件性敲除VEGFR3的CD8+T相比于对照组CD8+T对VEGFC的响应明显减弱。对于VEGFC体内功能的验证，注射重组VEGFC蛋白的GvHD小鼠病程显著加速，造成外周血和多种组织中的炎性浸润增加以及CD8+T细胞上调。详细探究MSCs产生VEGFC的调控机制，我们发现炎症因子TNF-α至关重要，而Dex进一步上调TNF-α诱导的VEGFC的表达，这种上调作用依赖于糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor,GR)。在本研究中我们首次发现VEGFC-VEGFR3受体配体结合对CD8+T细胞的增殖有正向调控作用，其可作为潜在靶点有效提高临床MSCs治疗GvHD的效果。 MSCs作为肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤免疫中发挥举足轻重的调节作用。MSCs能够与肿瘤细胞及微环境中的多种细胞通过细胞因子、趋化因子、黏附分子等相互作用，调节免疫系统的功能。同时，GCs在肿瘤临床治疗中也具有广泛的应用:可被用于控制放化疗引起的恶心、呕吐等副作用，常与多种化疗药物联用;此外，GCs也可作为抗肿瘤药物治疗淋巴瘤、白血病和多种黑色素瘤。然而已知的报道显示GCs并不直接杀死肿瘤细胞，其抗肿瘤机制还不明确。本研究致力从肿瘤免疫的角度探究GCs治疗黑色素瘤的机制。基于之前对MSCs免疫调节的可塑性研究，及MSCs调控肿瘤微环境的相关研究，我们提出假设:GCs类药物Dex通过调节肿瘤微环境中的MSCs来间接调控肿瘤免疫，从而抑制黑色素瘤的生长。我们通过将B16黑色素瘤与MSCs共同肌肉注射创造B16-MSCs的肿瘤-间质微环境，肿瘤生长在输注Dex之后受到明显抑制。同时，外周血和肿瘤局部的CD8+T细胞的数量和杀伤功能有明显提高。Dex的这种抗肿瘤作用在NOD/SCID和β2M-/-小鼠中却没有被观察到，提示相关作用与免疫系统中的CD8+T细胞密不可分。在体外共培养体系也观察到类似的Dex促进CD8+T增殖和功能的现象。通过检测加入Dex前后共培养体系内MSCs表面的共刺激分子表达变化，我们发现，Dex可下调MSCs表面抑制性分子PD-L1的表达。同时，我们证明，Dex也能下调体内肿瘤基质中MSCs的PD-L1表达。在小鼠黑色素瘤中，PD-L1过表达的MSCs相比于正常的MSCs，失去了响应Dex产生的抗肿瘤作用。这表明在肿瘤微环境，MSCs表面的PD-L1能保护肿瘤细胞免受免疫监督查杀，而Dex通过下调基质MSCs的PD-L1解除了抑制性信号，促进了CD8+T细胞的杀伤功能，促进了肿瘤免疫。 综上所述，本文明确了GCs调节MSCs产生免疫促进作用的分子机制，并证明这种免疫促进效果在不同的疾病中会带来正反两个方面效应:一方面，在自身免疫性疾病中，GCs干扰了MSCs的治疗效果;另一方面，在肿瘤中，GCs通过调节微环境中的MSCs促进抗肿瘤免疫。在GvHD中，GCs通过上调炎症因子TNF-α诱导的VEGFC表达，促进了CD8+T的增殖从而调控MSCs的免疫促进作用。而在肿瘤中，GCs又通过下调炎症因子IFN-γ诱导的PD-L1的表达，从而解除了肿瘤微环境局部对CD8+T细胞的抑制作用，促进其增殖和杀伤功能，产生免疫促进及抗肿瘤效果。以上研究将为临床上糖皮质激素及间充质干细胞的合理使用提供理论依据，对特异性提高MSCs的免疫调节功能提供潜在靶点，也为有效打破免疫耐受提高抗肿瘤效果提供了新思路。