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甜菊糖是一种优秀的天然甜味剂，健康安全，目前主要来源于甜叶菊提取。但天然来源的甜菊糖由于受到生长环境、提取工艺，糖基化修饰不同等影响，组分复杂，品质不稳定。使用易于操作的生物底盘进行甜菊糖异源合成，是理想的替代途径。本实验室前期的工作已经在大肠杆菌中成功构建了甜菊糖莱鲍迪苷A异源合成途径，但是产量较低且发酵产物中有大量的贝壳烯酸积累，贝壳烯酸向甜菊醇转化的这一步酶促反应受到贝壳烯酸13α-羟基化酶(Kaurenoic acid13α-hydroxylase，KAH)的限制。针对这一问题，本论文从前体途径动态调控，新来源KAH的筛选和设计，以及不同模块间的精细调适等三方面进行了研究。 香叶酰基香叶酰基焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）和二甲丙烯基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)是萜类化合物合成的共同前体，其积累会对产物的合成造成影响。特定响应这类物质的启动子，有望实现对这类物质浓度的动态调控。本研究在积累GGPP和DMAPP的大肠杆菌系统中，通过芯片分析和筛选，得到了可响应GGPP的2个启动子PyeaM，PmalG，及可响应DMAPP的4个启动子PmetF，PexbD，PyeaM，PmalG，并将其用于构建动态调控模块，以调控贝壳杉烯合成途径中的GGPP/DMAPP浓度。结果发现，在E.coli BL21(DE3)体系中，启动子PyeaM有较好的GGPP响应自调控功能，在添加IPTG和不添加IPTG条件下，贝壳杉烯产量为50.8±23.7mg/L和43.7±19.9mg/L，而其对照菌株GCK在两种条件下贝壳杉烯产量分别为114.41±11.88mg/L和71.13±8.28mg/L;PmetF启动子有较好的DMAPP响应自调控功能，在添加诱导剂的条件和不添加诱导剂的条件下产量为613.96±38.55mg/L和346.92±43.88mg/L，其对照菌株DCK在两种条件下贝壳杉烯产量为32.75±4.63mg/L和10.81±0.44mg/L，使用PmetF启动子的DMAPP响应自调控菌株，不诱导条件下产量是对照菌株诱导条件下产量的10.6倍。 细胞色素P450酶是许多天然产物异源合成途径中的难点。为了解除KAH的催化瓶颈，我们从改善P450酶的功能性表达及挖掘新来源的KAH和其对应的还原酶(Cytochrome P450reductase，CPR)两方面进行了尝试。通过两层标签的策略——麦芽糖结合蛋白标签(Maltose-binding protein tag，MBP)+CYP17A1的N端8个氨基酸残基(Modified CYP17A1N terminal，17α)——有效改善了KAH在E.coli中的功能性表达。静息细胞转化的结果显示，MBP-17αtr29CYP714A2的转化率是原构建17αtr29CYP714A2的1.93倍。通过对植物转录组数据的挖掘，成功获得了1个新的KAH可将贝壳烯酸转化为甜菊醇;也得到了2个全新的P450酶，可将贝壳烯酸转化成甜菊醇的同分异构体，并挖掘到3个全新的CPR，并将其与KAH进行了组合实验，发现KAH与RsCPR2组合有较高的转化效率。为了避免多个质粒共转的不便，我们运用CRISPR-Cas9系统将质粒上的MVA途径整合到了BL21(DE3)染色体中，得到了可以补充萜类合成前体DMAPP/异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP）的菌株SHJ01。以此为出发菌株，本研究中获得的KAH和CPR最终得到甜菊醇的产量(3.12±0.55mg/L)是对照产量（0.55±0.11mg/L）的5.7倍。 以SHJ01为宿主，通过不同拷贝数（3个水平）和启动子强度（3个水平）组合，对二萜合成模块和P450修饰模块的转录水平进行调节和优化，甜菊醇产量从0.29±0.14mg/L提高到7.33±0.66mg/L，产量提高了24倍。 综上所述，本研究成功筛选到了可响应GGPP/DMAPP积累的启动子，并将其应用于E.coli中二萜母核贝壳杉烯的异源合成。通过两层标签策略，改善了细胞色素P450酶在大肠杆菌中的功能性表达;通过挖掘获得了新的KAH酶和CPR，并对其组合适配进行了研究，改善了KAH的催化瓶颈;通过萜类合成模块和P450模块的计量比精细调节，成功将甜菊醇的产量提高为原来的24倍。本研究的发现、方法和策略可为其他植物源萜类物质的异源合成提供借鉴。