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目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty livcr disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损伤因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪性肝病以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化[1-2]；目前,NAFLD的具体发病机制并不是十分清楚,是一种代谢应激性肝损伤,其与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关[3-5]。本实验旨在通过改良高脂饮食建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型,通过时间点的变化来研究磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI-3K)、二酰甘油酰基转移酶2(AcylCoA:DiacylgycerolAcyltransferase-2,DGAT2)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的亚型PKC-ε在脂肪肝的表达量的变化,从而进一步探索NAFLD的发病机制。
方法:健康成年雄性Spague-Dawlay(SD)大鼠48只(150-180g),按随机表法随机分为2组,设立4、8、12周高脂喂养模型组(H组),并设立同时相正常喂养组(N组)作为对照,每组8只。正常饮食组给予基础饲料(泸州医院实验动物中心提供),模型组给予高脂饮食(即制备的改良高脂饲料:胆固醇含2％,胆酸钠含0.5％,丙硫氧嘧啶含0.2％,蔗糖含5％,猪油含10％,基础饲料含82.3％[6]),两组饮料均为自来水,自由饮用。造模4、8、12周末时分别处死对照组及模型组大鼠各8只,心脏采血,测量大鼠的血清转氨酶(AST、ALT)以及胆固醇(TC),以观察大鼠非酒精性脂肪性肝病模型肝脂变进展；然后迅速取出肝脏称肝湿重,计算肝指数:肝湿质量/体质量×100％。取肝组织标本,制备石蜡切片,行苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织光镜下的病理改变,并观察肝脏脂肪变程度；免疫组织化学法检测PKC-ε在肝组织中的表达情况；实时荧光定量PCR法(real-time quantitativePCR)检测肝脏PI-3K mRNA以及DGAT2 mRNA的表达。计量资料用均数±标准差((x)+SD)表示,采用t检验,组间比较采用方差分析,方差齐者采用单因素方差分析,方差不齐者采用H检验,比较模型组与对照组及模型组间在血清学、病理学等指标的差别,P<0.05有统计学意义。
结果:1.血清生化学指标:(1)肝功能和血脂:模型组AST、ALT和TC随着造模时间的逐渐延长与正常组相比明显升高。2.病理学观察:(1)肝脏大体观察:肉眼可见大鼠正常组肝脏呈鲜红色；与之比较模型组肝脏肉眼观即可出现肝脏颜色变黄,有油腻感,肝脏体积增大。(2)组织学观察:正常组大鼠肝小叶结构清晰,肝窦网状纤维疏松。模型组4、8、12周动物肝组织出现中至重度肝细胞脂肪变性,随造模时间延长脂肪变程度、气球样变以及纤维化程度逐渐加重,均高于对照组(P<0.05)。NAFLD病理改变中脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶内炎症和纤维化发生普遍,并且脂肪变性与小叶内炎症、纤维化及肝细胞气球样变程度间呈正相关关系。3.PKC-ε免疫组织化学法的表达:对照组肝脏中呈散在分布,胞浆内着色,弱阳性。模型组PKC-ε在肝脏的细胞膜及细胞浆内呈明显的棕黄色阳性表达,随着时间的延长,棕黄色的阳性表达逐渐加深,并呈片状分布,分布的范围越广,且表达量较正常对照组明显增加。造模4周时,肝细胞着色较正常组深,散在分布。造模8周时,棕黄色颗粒在阳性细胞的表达加深,分布较密集,阳性细胞增多。造模12周时,可见阳性细胞增加,棕黄色表达进一步加深,呈弥漫、大片分布。4.荧光定量PI-3K mRNA及DGAT2 mRNA在肝组织的表达:PI-3K mRNA在模型组随着脂肪变、纤维化、炎症程度的加重,表达量逐渐减少且模型组各组之间与正常组表达量相比明显减少(P<0.05);DGAT2 mRNA在模型组随着肝脂肪变、纤维化、炎症程度的加重,表达量逐渐上升且模型组各组之间与正常组表达量相比呈显著增加(P<0.05)。
结论:1.PI-3K(p85a)mRNA表达随着NAFLD的肝脂肪变程度加重,其表达量逐渐降低,PI-3K(p85a)mRNA表达与NAFLD的肝脂肪变程度呈负相关。2.随着模型组脂肪肝程度的加重PKC-ε、DGAT2表达量也明显增加,PI-3K的表达量相应降低,PKC-ε、DGAT2的表达与PI-3K的表达呈负相关,与肝脂肪变程度呈正相关。
方法:健康成年雄性Spague-Dawlay(SD)大鼠48只(150-180g),按随机表法随机分为2组,设立4、8、12周高脂喂养模型组(H组),并设立同时相正常喂养组(N组)作为对照,每组8只。正常饮食组给予基础饲料(泸州医院实验动物中心提供),模型组给予高脂饮食(即制备的改良高脂饲料:胆固醇含2％,胆酸钠含0.5％,丙硫氧嘧啶含0.2％,蔗糖含5％,猪油含10％,基础饲料含82.3％[6]),两组饮料均为自来水,自由饮用。造模4、8、12周末时分别处死对照组及模型组大鼠各8只,心脏采血,测量大鼠的血清转氨酶(AST、ALT)以及胆固醇(TC),以观察大鼠非酒精性脂肪性肝病模型肝脂变进展；然后迅速取出肝脏称肝湿重,计算肝指数:肝湿质量/体质量×100％。取肝组织标本,制备石蜡切片,行苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织光镜下的病理改变,并观察肝脏脂肪变程度；免疫组织化学法检测PKC-ε在肝组织中的表达情况；实时荧光定量PCR法(real-time quantitativePCR)检测肝脏PI-3K mRNA以及DGAT2 mRNA的表达。计量资料用均数±标准差((x)+SD)表示,采用t检验,组间比较采用方差分析,方差齐者采用单因素方差分析,方差不齐者采用H检验,比较模型组与对照组及模型组间在血清学、病理学等指标的差别,P<0.05有统计学意义。
结果:1.血清生化学指标:(1)肝功能和血脂:模型组AST、ALT和TC随着造模时间的逐渐延长与正常组相比明显升高。2.病理学观察:(1)肝脏大体观察:肉眼可见大鼠正常组肝脏呈鲜红色；与之比较模型组肝脏肉眼观即可出现肝脏颜色变黄,有油腻感,肝脏体积增大。(2)组织学观察:正常组大鼠肝小叶结构清晰,肝窦网状纤维疏松。模型组4、8、12周动物肝组织出现中至重度肝细胞脂肪变性,随造模时间延长脂肪变程度、气球样变以及纤维化程度逐渐加重,均高于对照组(P<0.05)。NAFLD病理改变中脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶内炎症和纤维化发生普遍,并且脂肪变性与小叶内炎症、纤维化及肝细胞气球样变程度间呈正相关关系。3.PKC-ε免疫组织化学法的表达:对照组肝脏中呈散在分布,胞浆内着色,弱阳性。模型组PKC-ε在肝脏的细胞膜及细胞浆内呈明显的棕黄色阳性表达,随着时间的延长,棕黄色的阳性表达逐渐加深,并呈片状分布,分布的范围越广,且表达量较正常对照组明显增加。造模4周时,肝细胞着色较正常组深,散在分布。造模8周时,棕黄色颗粒在阳性细胞的表达加深,分布较密集,阳性细胞增多。造模12周时,可见阳性细胞增加,棕黄色表达进一步加深,呈弥漫、大片分布。4.荧光定量PI-3K mRNA及DGAT2 mRNA在肝组织的表达:PI-3K mRNA在模型组随着脂肪变、纤维化、炎症程度的加重,表达量逐渐减少且模型组各组之间与正常组表达量相比明显减少(P<0.05);DGAT2 mRNA在模型组随着肝脂肪变、纤维化、炎症程度的加重,表达量逐渐上升且模型组各组之间与正常组表达量相比呈显著增加(P<0.05)。
结论:1.PI-3K(p85a)mRNA表达随着NAFLD的肝脂肪变程度加重,其表达量逐渐降低,PI-3K(p85a)mRNA表达与NAFLD的肝脂肪变程度呈负相关。2.随着模型组脂肪肝程度的加重PKC-ε、DGAT2表达量也明显增加,PI-3K的表达量相应降低,PKC-ε、DGAT2的表达与PI-3K的表达呈负相关,与肝脂肪变程度呈正相关。