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目的:研究威灵仙皂苷是否能够诱导耐全反式维甲酸急性早幼粒细胞白血病细胞株(MR2细胞株)凋亡,以期望寻找一种治疗急性早幼粒细胞白血病耐药患者的新药,尽可能的减轻临床症状,提高生存质量,防止复发转移,延长生存期。
方法:根据文献自行提取威灵仙皂苷。常规培养人MR2细胞株于含10％小牛血清的RPMI1640培养基的25ml培养瓶中,置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每3～5天传代一次,取对数生长期的细胞作实验对象,将细胞浓度调整为1×104个/ml的细胞悬液接种于96孔酶标板,每孔加细胞悬液100ul,共设8个实验组(每组5个平行孔,并重复实验3次),以终浓度0.01％DMS0为空白对照组,终浓度1.0umol/l亚砷酸为阳性对照组,终浓度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组,用WST-1法观察不同浓度不同时间威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用；调整细胞浓度为1×106个/ml接种子六孔板,设五个实验组(每组设三个平行对照,实验重复三次),以终浓度0.01％DMSO为空白对照组,终浓度1umol/ml亚砷酸为阳性对照组,终浓度800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组,作用MR2细胞72小时后用流式细胞仪观察MR2细胞的凋亡率；调整细胞浓度为4×105个/ml接种于六孔板,设五个实验组(每组设三个平行对照,实验重复三次),以终浓度0.01％DMSO为空白对照组,终浓度1umol/1亚砷酸为阳性对照组,终浓度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组,作用MR2细胞72小时后用AnnexinV-FITC染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态,并应用统计学分析实验结果。
结果:WST-1法结果显示不同浓度的威灵仙皂苷(200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml)对MR2细胞均有明显的增殖抑制作用,且呈时间和浓度依赖性。可明显抑制MR2细胞的增殖并随着威灵仙皂苷浓度的增加、作用时间的延长而抑制作用增强,且高浓度的威灵仙皂苷组与亚砷酸组对MR2细胞增殖抑制作用无统计学差异；应用流式细胞仪技术可明显检测到MR2细胞的凋亡且随浓度的增加而凋亡率升高,亚砷酸组与皂苷1200ug/ml组之间差异无统计学意义；亚砷酸组和皂苷1200ug/ml组与皂苷800ug/ml、1000ug/ml组间差异有统计学意义；皂苷800ug/ml组与皂苷1000ug/ml组间差异有统计学意义。AnnexinV是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,可在细胞凋亡时与翻向外侧的磷脂酰丝氨酸胞膜结合,使其荧光信号呈绿光；PI作为一种核酸染料,它不能通过完整的细胞膜,但在细胞凋亡时和细胞死亡时能通过细胞膜使细胞核染色,其荧光信号呈红光。通过荧光显微镜可以观察到威灵仙皂苷作用MR2细胞经AnnexinV-FITC染色后出现细胞体积变小,细胞核浓缩,细胞核碎裂以及凋亡小体形成等细胞凋亡的形态改变。
结论:1.威灵仙皂苷能够明显抑制MR2细胞的增殖,且呈时间浓度依赖性。2.威灵仙皂苷能够诱导MR2细胞凋亡,呈浓度依赖性,且高浓度组与亚砷酸的凋亡率差异无统计学意义。3.威灵仙皂苷单独或联合其它药物可能成为临床上治疗急性早幼粒细胞白血病及其耐药患者的一种新的经济、有效、安全的药物。
方法:根据文献自行提取威灵仙皂苷。常规培养人MR2细胞株于含10％小牛血清的RPMI1640培养基的25ml培养瓶中,置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每3～5天传代一次,取对数生长期的细胞作实验对象,将细胞浓度调整为1×104个/ml的细胞悬液接种于96孔酶标板,每孔加细胞悬液100ul,共设8个实验组(每组5个平行孔,并重复实验3次),以终浓度0.01％DMS0为空白对照组,终浓度1.0umol/l亚砷酸为阳性对照组,终浓度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组,用WST-1法观察不同浓度不同时间威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用；调整细胞浓度为1×106个/ml接种子六孔板,设五个实验组(每组设三个平行对照,实验重复三次),以终浓度0.01％DMSO为空白对照组,终浓度1umol/ml亚砷酸为阳性对照组,终浓度800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组,作用MR2细胞72小时后用流式细胞仪观察MR2细胞的凋亡率；调整细胞浓度为4×105个/ml接种于六孔板,设五个实验组(每组设三个平行对照,实验重复三次),以终浓度0.01％DMSO为空白对照组,终浓度1umol/1亚砷酸为阳性对照组,终浓度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组,作用MR2细胞72小时后用AnnexinV-FITC染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态,并应用统计学分析实验结果。
结果:WST-1法结果显示不同浓度的威灵仙皂苷(200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml)对MR2细胞均有明显的增殖抑制作用,且呈时间和浓度依赖性。可明显抑制MR2细胞的增殖并随着威灵仙皂苷浓度的增加、作用时间的延长而抑制作用增强,且高浓度的威灵仙皂苷组与亚砷酸组对MR2细胞增殖抑制作用无统计学差异；应用流式细胞仪技术可明显检测到MR2细胞的凋亡且随浓度的增加而凋亡率升高,亚砷酸组与皂苷1200ug/ml组之间差异无统计学意义；亚砷酸组和皂苷1200ug/ml组与皂苷800ug/ml、1000ug/ml组间差异有统计学意义；皂苷800ug/ml组与皂苷1000ug/ml组间差异有统计学意义。AnnexinV是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,可在细胞凋亡时与翻向外侧的磷脂酰丝氨酸胞膜结合,使其荧光信号呈绿光；PI作为一种核酸染料,它不能通过完整的细胞膜,但在细胞凋亡时和细胞死亡时能通过细胞膜使细胞核染色,其荧光信号呈红光。通过荧光显微镜可以观察到威灵仙皂苷作用MR2细胞经AnnexinV-FITC染色后出现细胞体积变小,细胞核浓缩,细胞核碎裂以及凋亡小体形成等细胞凋亡的形态改变。
结论:1.威灵仙皂苷能够明显抑制MR2细胞的增殖,且呈时间浓度依赖性。2.威灵仙皂苷能够诱导MR2细胞凋亡,呈浓度依赖性,且高浓度组与亚砷酸的凋亡率差异无统计学意义。3.威灵仙皂苷单独或联合其它药物可能成为临床上治疗急性早幼粒细胞白血病及其耐药患者的一种新的经济、有效、安全的药物。