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植物在生长过程中受到许多生物和非生物胁迫的影响，为了适应复杂的环境，植物进化出适应性防御机制，以抵抗各种逆境伤害。其中转录因子在将感知的应激信号转化为应激反应基因表达中至关重要。小麦叶锈菌（Puccinia triticina）是危害小麦生产的重要病原物，所以从小麦中筛选具有抗病潜力的NAC转录因子，并研究其在对抗叶锈菌中的生物学作用，可为小麦转基因分子育种实践提供候选基因资源，丰富小麦抗叶锈病机制研究。近年来，已经阐明多种NAC转录因子在生物与非生物胁迫反应中起重要作用，关于NAC转录因子在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用鲜有报道。本研究克隆了一个小麦中的TaNAC35转录因子，并对其转录激活活性、亚细胞定位、表达特征以及其在小麦受叶锈菌侵染中的功能进行了初步分析。主要研究结果如下:
(1)从实验室前期小麦接种叶锈病菌的毒力小种THTT构建的cDNA文库中筛选到一个受叶锈菌诱导表达量发生变化的NAC转录因子。以小麦材料TcLr3ka、TcLr14b、TcLr19、TcLr21的cDNA为模板，通过同源克隆获得基因ORF序列，分析发现该基因序列在不同材料中完全一致，包含1164bp的完整开放阅读框，编码一条由388个氨基酸组成的肽链，具有高度保守的N末端NAM结构域(40～187aa)和可变的C末端转录调节结构域;BLASTP分析显示，候选NAC蛋白与多种单子叶植物NAC蛋白序列具有较高同源性，与Aegilops tauschii亚种AttNAC35相似性最高(95.9％)，将该基因被命名为TaNAC35;
(2)通过酵母单杂交进行转录自激活分析，发现TaNAC35蛋白的非保守C端具有转录激活功能;通过目的基因融合GFP标签，使用本氏烟草叶片细胞进行了亚细胞定位，发现其定位在细胞核上，符合转录因子的基本特征;
(3)为了进一步表征TaNAC35在抗叶锈病中的功能，使用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默(VIGS)系统，发现在TcLr3ka和毒性小种THTT的亲和互作反应中，沉默TaNAC35后植株由感病表型“4”变为抗病表型“;”;在TcLr14b沉默植株中，由感病表型“4”变为抗病表型“1”。通过详细的组织学观察发现两个小麦材料中沉默TaNAC35后均影响到叶锈菌的侵染过程，主要表现为吸器母细胞减少、菌丝扩展减慢;在抗性材料TcLr19和THTT的非亲和组合中未发现明显的表型变化，分析TaNAC35在小麦与叶锈菌互作的防御反应中发挥负调控作用;
(4)利用qRT-PCR技术分析TaNAC35在小麦叶锈菌侵染和外源激素(SA、MEJA、ABA)处理后的表达特征，发现TaNAC35在小麦-叶锈菌互作的亲和反应中，基因相对表达量均呈现波动式变化，在接菌后6h叶锈菌萌发和36h产生侵染结构的时间表达明显上升，说明TaNAC35在响应叶锈菌侵染过程中发挥一定作用。此外在亲和反应中TaNAC35转录水平普遍高于非亲和反应，也验证了TaNAC35在小麦与叶锈菌互作的过程中是一个负调控因子。外源激素ABA处理后不会引起TaNAC35表达水平的显著变化，MeJA处理下TaNAC35相对表达量发生较大波动，主要呈上调趋势;SA处理下，TaNAC35基因在0～24h表达量整体呈上升趋势，24h表达量增加到原来的6倍，后期表达量逐渐下降。TaNAC35表达具有组织特异性，在叶中积累最多，根中和茎秆中次之，幼穗中最少。
综合上述结果，表明TaNAC35在小麦与叶锈菌互作的过程中通过负调控作用调控相关基因的表达并参与激素介导的信号途径而发挥其作用，SA和MeJA信号通路可能通过相互促进，来响应小麦叶锈菌的侵袭。
(1)从实验室前期小麦接种叶锈病菌的毒力小种THTT构建的cDNA文库中筛选到一个受叶锈菌诱导表达量发生变化的NAC转录因子。以小麦材料TcLr3ka、TcLr14b、TcLr19、TcLr21的cDNA为模板，通过同源克隆获得基因ORF序列，分析发现该基因序列在不同材料中完全一致，包含1164bp的完整开放阅读框，编码一条由388个氨基酸组成的肽链，具有高度保守的N末端NAM结构域(40～187aa)和可变的C末端转录调节结构域;BLASTP分析显示，候选NAC蛋白与多种单子叶植物NAC蛋白序列具有较高同源性，与Aegilops tauschii亚种AttNAC35相似性最高(95.9％)，将该基因被命名为TaNAC35;
(2)通过酵母单杂交进行转录自激活分析，发现TaNAC35蛋白的非保守C端具有转录激活功能;通过目的基因融合GFP标签，使用本氏烟草叶片细胞进行了亚细胞定位，发现其定位在细胞核上，符合转录因子的基本特征;
(3)为了进一步表征TaNAC35在抗叶锈病中的功能，使用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默(VIGS)系统，发现在TcLr3ka和毒性小种THTT的亲和互作反应中，沉默TaNAC35后植株由感病表型“4”变为抗病表型“;”;在TcLr14b沉默植株中，由感病表型“4”变为抗病表型“1”。通过详细的组织学观察发现两个小麦材料中沉默TaNAC35后均影响到叶锈菌的侵染过程，主要表现为吸器母细胞减少、菌丝扩展减慢;在抗性材料TcLr19和THTT的非亲和组合中未发现明显的表型变化，分析TaNAC35在小麦与叶锈菌互作的防御反应中发挥负调控作用;
(4)利用qRT-PCR技术分析TaNAC35在小麦叶锈菌侵染和外源激素(SA、MEJA、ABA)处理后的表达特征，发现TaNAC35在小麦-叶锈菌互作的亲和反应中，基因相对表达量均呈现波动式变化，在接菌后6h叶锈菌萌发和36h产生侵染结构的时间表达明显上升，说明TaNAC35在响应叶锈菌侵染过程中发挥一定作用。此外在亲和反应中TaNAC35转录水平普遍高于非亲和反应，也验证了TaNAC35在小麦与叶锈菌互作的过程中是一个负调控因子。外源激素ABA处理后不会引起TaNAC35表达水平的显著变化，MeJA处理下TaNAC35相对表达量发生较大波动，主要呈上调趋势;SA处理下，TaNAC35基因在0～24h表达量整体呈上升趋势，24h表达量增加到原来的6倍，后期表达量逐渐下降。TaNAC35表达具有组织特异性，在叶中积累最多，根中和茎秆中次之，幼穗中最少。
综合上述结果，表明TaNAC35在小麦与叶锈菌互作的过程中通过负调控作用调控相关基因的表达并参与激素介导的信号途径而发挥其作用，SA和MeJA信号通路可能通过相互促进，来响应小麦叶锈菌的侵袭。