论文部分内容阅读
慢性心力衰竭(简称慢性心衰)是各种心血管疾病的最终转归，已成为严重危害人类健康的重大公共卫生问题。慢性心衰是一系列复杂、连锁、动态的病理过程，其实质是能量不足而引起的一种超负荷性心肌病，心脏能量代谢障碍是慢性心衰重要病理生理学基础。中医脉络学说指出慢性心衰“气阳虚乏，络瘀水停，络息心积”病机特点，卫阳不足，温煦失司，运化失权，营卫交会生化异常，气、血、水三者互患形成恶性病理循环，引起络息心积。并提出了“气血水同治分消”的治疗原则及“益气温阳、活血通络、利水消肿”的治法，在此基础上确立了芪苈强心胶囊组方。本研究采用结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)方法建立心梗后慢性心衰大鼠模型，通过探讨芪苈强心胶囊对慢性心衰大鼠心肌纤维化、炎症反应、微血管内皮保护因子的干预作用，揭示其改善心功能的作用；通过探讨芪苈强心胶囊对慢性心衰大鼠心脏脂肪酸代谢及氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的干预作用，揭示其改善慢性心衰心脏能量代谢的作用及机制。
第一部分芪苈强心胶囊对心梗后慢性心力衰竭大鼠心功能不全的作用研究
目的：探讨芪苈强心胶囊对心梗后慢性心衰大鼠心功能不全的作用。
方法：采用结扎LAD方法建立心梗后慢性心衰大鼠模型，雄性SD大鼠分为6组：假手术组(Sham)、模型组(Model)、芪苈强心低剂量组(QLQX-L, 0.25g/kg/d)、芪苈强心中剂量组(QLQX-M, 0. 5g/kg/d)、芪苈强心高剂量组(QLQX-H, 1.0g/kg/d)和贝那普利组(Benazepril,10mg/kg/d)，每组10只，Sham组大鼠在相同手术部位只穿线不结扎。4周后小动物超声检测心功能，左室射血分数(left ventricular ejection fraction,EF)＜50%视为慢性心衰模型建立成功，按上述剂量灌胃给药，Sham和Model组给予同体积生理盐水，连续给药4周。4周后利用小动物超声检测心功能、酶联免疫法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测血浆氨基末端脑钠肽前体(N terminal-pro brain natriuretic peptide,NT-proBNP)水平；苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosinstaining,HEstaining)、Masson染色观察心肌组织形态学改变；定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction, QRT-PCR)及Westernblot法检测心肌组织纤维化指标基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)mRNA及蛋白表达水平；ELISA法检测血清炎性相关因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)，白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)水平；检测血浆微血管内皮保护因子神经调节蛋白-1(neuregulin-1, Nrg-1)水平。
结果：
超声心动图结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic internal diameter,LVEDd)和左室收缩末内径(left ventricular end-systolic internal diameter,LVESd)明显升高(P＜0.01),EF及左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,FS)明显降低(P＜0.01)；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后明显降低了慢性心衰大鼠LVEDd及LVESd,升高了EF及FS(P＜0.01)。
血浆NT-proBNP水平结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血浆NT-proBNP水平显著上调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血浆NT-proBNP水平显著下调(P＜0.01)。
HE染色结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌细胞肥大水肿，肌纤维断裂萎缩，心肌细胞坏死，心肌纤维化加重；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后抑制了慢性心衰大鼠心肌细胞肥大水肿，肌纤维断裂和萎缩变性，心肌细胞坏死和纤维化。
Masson染色结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌及血管周围胶原纤维明显增生；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril可不同程度抑制心衰大鼠心肌及血管周围胶原纤维增生情况。
心肌组织MMP2、MMP9、ColⅠ、ColⅢmRNA及蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织MMP2、MMP9、ColⅠ、ColⅢmRNA及蛋白表达水平显著上调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠心肌组织MMP2、MMP9、ColⅠ、ColⅢmRNA及蛋白表达量显著下调(P＜0.01)。
血清TNF-α、IL-1β水平结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著上调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著下调(P＜0.01)。
血浆Nrg-1水平结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血浆Nrg-1水平显著降低(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血浆Nrg-1水平显著升高(P＜0.01)。
小结：
1.以脉络学说为指导，揭示慢性心衰营卫“由络以通，交会生化”异常导致“气阳虚乏，络瘀水停，络息心积”病机特点，并提出“气血水同治分消”治疗原则及“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法，据此研制了芪苈强心胶囊。
2.慢性心衰病程中炎症反应激活、微血管内皮功能损伤，进而引起心肌纤维化，血浆NT-proBNP水平增高，心功能不全，佐证了慢性心衰“络息心积”病机特点。芪苈强心胶囊通过抗炎，改善微血管内皮细胞损伤，进而抑制心肌纤维化，改善心功能，治疗大鼠心梗后慢性心衰疗效明显，佐证了中医脉络学说对慢性心衰防治的指导价值。
第二部分芪苈强心胶囊改善心力衰竭大鼠心脏脂肪酸代谢的作用研究
目的：探讨芪苈强心胶囊对心力衰竭大鼠心脏脂肪酸代谢的作用。
方法：慢性心衰大鼠实验动物和分组给药方法同前。化学发光法检测各组大鼠心肌组织三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)含量；溶氧电解法及荧光法检测大鼠心肌组织线粒体氧化呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR)及线粒体膜电位(mitochondria membrane potential, MMP)；比色法检测大鼠血清和心肌组织游离脂肪酸(free fattyacid,FFA)含量；QRT-PCR及Westernblot方法检测各组大鼠心肌组织肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,Cpt-1)、中链脂酰辅酶A脱氢酶(medium-chain acyl-COA dehydrogenase,MCAD)、长链脂酰辅酶A脱氢酶(long-chain acyl-COA dehydrogenase,LCAD)、过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorα,PPARα)、过氧化物酶体增殖激活受体共激活因子-1α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator-1α,PGC-1α)mRNA和蛋白表达水平。
结果：
心肌组织ATP含量结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织ATP含量明显降低(P＜0.01)；与Model组相比，给予QLQX和Benazepril后大鼠心肌组织ATP含量升高(P＜0.01)。
心肌组织线粒体RCR和MMP水平结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织线粒体RCR和MMP水平明显降低(P＜0.01)；与Model组相比，给予QLQX和Benazepril后大鼠心肌组织线粒体RCR和MMP水平升高(P＜0.05)。
血清和心肌组织FFA水平结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠血清和心肌组织FFA水平明显升高(P＜0.01)；与Model组相比，给予QLQX和Benazepril后显著降低了大鼠血清和心肌组织FFA水平(P＜0.01)。
心肌组织Cpt-1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织Cpt-1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达量显著下调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠心肌组织Cpt-1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达量显著上调(P＜0.05)。
心肌组织PPARα、PGC-1αmRNA及蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织PPARα、PGC-1αmRNA及蛋白表达量显著下调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠心肌组织PPARα、PGC-1αmRNA及蛋白表达量显著上调(P＜0.01)。
小结：
1.脉络学说认为营卫“由络以通，交会生化”，即营卫以气血之体，作流通之用，二者相偕而行，在脉络末端之孙络会和聚集，进行气、血、津液等物质转化及能量代谢。慢性心衰“营卫交会生化”异常是以微血管内皮细胞为核心和启动因素、神经体液调节与血液成分共同参与、心肌细胞功能结构损伤的复杂病理过程，导致气、血、水等物质转化及能量代谢异常，形成络息心积，揭示了慢性心衰能量代谢障碍的病理特点。
2.心梗后慢性心衰病理进程中脂肪酸利用率降低，FFA堆积，线粒体氧化呼吸功能受损，ATP生成减少。芪苈强心胶囊可能通过激活PPARα/PGC-1α信号通路上调慢性心衰大鼠脂肪酸β氧化关键酶Cpt1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达水平，降低血清及心肌组织FFA含量，优化脂肪酸利用，升高心肌组织线粒体RCR及MMP水平，促进ATP生成，改善慢性心衰大鼠心脏能量代谢。
第三部分芪苈强心胶囊对氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的作用及机制研究
目的：通过动物实验和细胞实验探讨芪苈强心胶囊对氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的作用及机制。
方法：
心梗后慢性心衰大鼠实验动物和分组给药方法同前。利用ELISA及荧光法检测各组大鼠血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放水平、活性氧(reactive oxygen species, ROS)表达水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性；TUNEL检测心肌细胞凋亡率，Westernblot方法检测线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3及信号通路相关指标AKT、p-AKT、糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylatedglycogensynthasekinase-3β,p-GSK3β)蛋白表达水平。
细胞实验体外培养大鼠H9c2心肌细胞，暴露于H2O2中建立氧化应激损伤模型。使用MTS评价QLQX、H2O2和QLQX在H2O2损伤基础上对H9c2心肌细胞生存活性的影响。实验分为Normal组，H2O2组，H2O2+QLQX组，采用ELISA及荧光法检测各组细胞LDH释放水平、胞内ROS表达水平，SOD活性；QRT-PCR法检测细胞血红素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)、过氧化氢酶(catalase, CAT)mRNA表达水平。给予PI3K抑制剂LY294002后，流式细胞仪测各组细胞凋亡率，WesternBlot测线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Cytochromec、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3表达水平及信号通路AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表达水平。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态，WesternBlot测线粒体分裂指标磷酸化动力相关蛋白1(phosphorylated dynamin-related protein 1,p-Drp1)、动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)蛋白表达水平；流式细胞仪检测各组细胞线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放情况，荧光法分析各组细胞MMP水平。
结果：
1.揭示芪苈强心胶囊对心梗后慢性心力衰竭大鼠氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的作用
血清LDH释放水平、ROS表达水平和SOD活性结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血清LDH释放水平、ROS表达水平显著升高(P＜0.01)，SOD活性显著降低(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血清LDH释放水平、ROS表达水平显著降低(P＜0.05)，SOD活性明显升高(P＜0.05)。
心肌细胞凋亡率结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌细胞凋亡明显增多(P＜0.01)；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后均不同程度抑制了心衰大鼠心肌细胞凋亡(P＜0.01)。
心肌组织线粒体途径凋亡蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3表达量显著上调(P＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著下调；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后下调了上述促凋亡蛋白表达量，上调了Bcl-2蛋白表达水平(P＜0.01)。
p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比率结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比下调(P＜0.01)；给予QLQX和Benazepril后上调了p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比率(P＜0.05)。
2.揭示芪苈强心胶囊对H2O2损伤H9c2心肌细胞线粒体结构和功能的作用及机制
细胞生存活性结果显示，与Normal组相比，80μMH2O2损伤H9c2心肌细胞24h后生存活性降低至70.44%±3.81%(P＜0.01)适合做为造模浓度。QLQX作用H9c2心肌细胞24h后在＜200μg/mL范围内无细胞毒性。与H2O2组相比，QLQX作用H2O2损伤H9c2心肌细胞24h后，在90μg/mL浓度时促进了细胞增殖(P＜0.01)，因此确定该浓度为药物浓度。
LDH释放水平、ROS相对表达水平、SOD活性、HO-1和CATmRNA相对表达水平结果显示，与Normal组比较，H2O2损伤H9c2细胞24hLDH释放水平、ROS相对表达水平升高(P＜0.01)，SOD活性、HO-1和CATmRNA相对表达量降低(P＜0.01)；与H2O2组比较，给予QLQX后抑制了H2O2损伤H9c2细胞LDH释放水平、ROS相对表达水平，升高了SOD活性、HO-1和CATmRNA相对表达水平(P＜0.01)。
线粒体途径细胞凋亡结果显示，与Normal组比较，H2O2组H9c2细胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax，Cytochromec，Apaf-1，Cleaved-caspase9，Cleaved-caspase3表达水平显著升高(P＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低(P＜0.01)；与H2O2组比较，给予QLQX后显著降低了H2O2损伤H9c2细胞凋亡率及Bax，Cytochromec，Apaf-1，Cleaved-caspase9，Cleaved-caspase3蛋白表达水平(P＜0.01)，升高了Bcl-2蛋白表达水平(P＜0.01)；与H2O2+QLQX组比，给予PI3K抑制剂LY294002后部分扭转了QLQX组细胞凋亡率及线粒体途径凋亡蛋白表达趋势(P＜0.05)，且给予H2O2损伤H9c2细胞LY294002与H2O2组细胞凋亡情况相比无统计学差异。
p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比结果显示，与Normal组比较，H2O2组细胞p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比明显下调(P＜0.01)；与H2O2组比较，给予QLQX后上调了H2O2损伤H9c2细胞p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比(P＜0.01)；与H2O2+QLQX组比，给予LY294002后部分扭转了上述指标趋势(P＜0.01)；且给予H2O2损伤H9c2细胞LY294002与H2O2组细胞相比上述指标无统计学差异。
线粒体分裂，mPTP开放情况，MMP水平结果显示，与Normal组相比，H2O2组细胞线粒体分裂，mPTP开放，MMP下降(P＜0.01)；与H2O2组相比，给予QLQX后抑制了线粒体分裂，mPTP开放及MMP下降(P＜0.01)；与H2O2+QLQX组比，给予LY294002后部分扭转了QLQX抑制线粒体分裂，mPTP开放、MMP下降的作用(P＜0.05)；且给予H2O2损伤H9c2细胞LY294002与H2O2组细胞相比上述指标无统计学差异。
小结：
1.心梗后慢性心衰大鼠氧化应激损伤，心肌细胞线粒体结构和功能障碍，触发线粒体途径细胞凋亡。芪苈强心胶囊可通过PI3K/AKT/GSK3β通路延缓慢性心衰大鼠氧化应激损伤，抑制线粒体途径细胞凋亡，改善心肌细胞线粒体结构和功能。
2.H2O2诱导大鼠H9c2心肌细胞氧化应激损伤，线粒体结构和功能障碍，触发线粒体途径细胞凋亡。芪苈强心胶囊可通过PI3K/AKT/GSK3β通路抑制H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化应激损伤、线粒体分裂、mPTP开放、MMP下降及线粒体途径细胞凋亡，改善心肌细胞线粒体结构和功能。
结论：
1.脉络学说指出慢性心衰“气阳虚乏，络瘀水停，络息心积”病机特点，卫阳不足，温煦失司，运化失权，营卫交会生化异常，气、血、水三者互患形成恶性病理循环，引起络息心积；提出慢性心衰营卫“交会生化”异常是以微血管内皮细胞为核心和启动因素、神经体液调节与血液成分共同参与、心肌细胞结构功能损伤的复杂病理过程，揭示了慢性心衰能量代谢障碍的病理特点。本研究利用心梗后慢性心衰大鼠模型证明了心脏能量代谢异常是慢性心衰的重要病理生理学基础，利用H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型证明ROS通过损伤心肌细胞线粒体结构和功能引起心脏能量代谢障碍。
2.基于上述病机特点提出“气血水同治分消”治疗原则，确立“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法，并研制了芪苈强心胶囊。本研究利用心梗后慢性心衰大鼠和H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型，揭示了芪苈强心胶囊通过抑制氧化应激损伤改善心肌细胞线粒体结构和功能，优化脂肪酸利用改善心脏能量代谢，从而进一步减轻心肌纤维化，改善心功能，阐明了芪苈强心胶囊可通过调控能量代谢延缓慢性心衰进程。这为中医脉络学说指导慢性心衰防治理论提供了数据支撑，同时为这类疾病治疗开辟新的途径。
第一部分芪苈强心胶囊对心梗后慢性心力衰竭大鼠心功能不全的作用研究
目的：探讨芪苈强心胶囊对心梗后慢性心衰大鼠心功能不全的作用。
方法：采用结扎LAD方法建立心梗后慢性心衰大鼠模型，雄性SD大鼠分为6组：假手术组(Sham)、模型组(Model)、芪苈强心低剂量组(QLQX-L, 0.25g/kg/d)、芪苈强心中剂量组(QLQX-M, 0. 5g/kg/d)、芪苈强心高剂量组(QLQX-H, 1.0g/kg/d)和贝那普利组(Benazepril,10mg/kg/d)，每组10只，Sham组大鼠在相同手术部位只穿线不结扎。4周后小动物超声检测心功能，左室射血分数(left ventricular ejection fraction,EF)＜50%视为慢性心衰模型建立成功，按上述剂量灌胃给药，Sham和Model组给予同体积生理盐水，连续给药4周。4周后利用小动物超声检测心功能、酶联免疫法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测血浆氨基末端脑钠肽前体(N terminal-pro brain natriuretic peptide,NT-proBNP)水平；苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosinstaining,HEstaining)、Masson染色观察心肌组织形态学改变；定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction, QRT-PCR)及Westernblot法检测心肌组织纤维化指标基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)mRNA及蛋白表达水平；ELISA法检测血清炎性相关因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)，白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)水平；检测血浆微血管内皮保护因子神经调节蛋白-1(neuregulin-1, Nrg-1)水平。
结果：
超声心动图结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic internal diameter,LVEDd)和左室收缩末内径(left ventricular end-systolic internal diameter,LVESd)明显升高(P＜0.01),EF及左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,FS)明显降低(P＜0.01)；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后明显降低了慢性心衰大鼠LVEDd及LVESd,升高了EF及FS(P＜0.01)。
血浆NT-proBNP水平结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血浆NT-proBNP水平显著上调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血浆NT-proBNP水平显著下调(P＜0.01)。
HE染色结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌细胞肥大水肿，肌纤维断裂萎缩，心肌细胞坏死，心肌纤维化加重；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后抑制了慢性心衰大鼠心肌细胞肥大水肿，肌纤维断裂和萎缩变性，心肌细胞坏死和纤维化。
Masson染色结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌及血管周围胶原纤维明显增生；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril可不同程度抑制心衰大鼠心肌及血管周围胶原纤维增生情况。
心肌组织MMP2、MMP9、ColⅠ、ColⅢmRNA及蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织MMP2、MMP9、ColⅠ、ColⅢmRNA及蛋白表达水平显著上调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠心肌组织MMP2、MMP9、ColⅠ、ColⅢmRNA及蛋白表达量显著下调(P＜0.01)。
血清TNF-α、IL-1β水平结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著上调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平显著下调(P＜0.01)。
血浆Nrg-1水平结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血浆Nrg-1水平显著降低(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血浆Nrg-1水平显著升高(P＜0.01)。
小结：
1.以脉络学说为指导，揭示慢性心衰营卫“由络以通，交会生化”异常导致“气阳虚乏，络瘀水停，络息心积”病机特点，并提出“气血水同治分消”治疗原则及“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法，据此研制了芪苈强心胶囊。
2.慢性心衰病程中炎症反应激活、微血管内皮功能损伤，进而引起心肌纤维化，血浆NT-proBNP水平增高，心功能不全，佐证了慢性心衰“络息心积”病机特点。芪苈强心胶囊通过抗炎，改善微血管内皮细胞损伤，进而抑制心肌纤维化，改善心功能，治疗大鼠心梗后慢性心衰疗效明显，佐证了中医脉络学说对慢性心衰防治的指导价值。
第二部分芪苈强心胶囊改善心力衰竭大鼠心脏脂肪酸代谢的作用研究
目的：探讨芪苈强心胶囊对心力衰竭大鼠心脏脂肪酸代谢的作用。
方法：慢性心衰大鼠实验动物和分组给药方法同前。化学发光法检测各组大鼠心肌组织三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)含量；溶氧电解法及荧光法检测大鼠心肌组织线粒体氧化呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR)及线粒体膜电位(mitochondria membrane potential, MMP)；比色法检测大鼠血清和心肌组织游离脂肪酸(free fattyacid,FFA)含量；QRT-PCR及Westernblot方法检测各组大鼠心肌组织肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,Cpt-1)、中链脂酰辅酶A脱氢酶(medium-chain acyl-COA dehydrogenase,MCAD)、长链脂酰辅酶A脱氢酶(long-chain acyl-COA dehydrogenase,LCAD)、过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorα,PPARα)、过氧化物酶体增殖激活受体共激活因子-1α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator-1α,PGC-1α)mRNA和蛋白表达水平。
结果：
心肌组织ATP含量结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织ATP含量明显降低(P＜0.01)；与Model组相比，给予QLQX和Benazepril后大鼠心肌组织ATP含量升高(P＜0.01)。
心肌组织线粒体RCR和MMP水平结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠心肌组织线粒体RCR和MMP水平明显降低(P＜0.01)；与Model组相比，给予QLQX和Benazepril后大鼠心肌组织线粒体RCR和MMP水平升高(P＜0.05)。
血清和心肌组织FFA水平结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠血清和心肌组织FFA水平明显升高(P＜0.01)；与Model组相比，给予QLQX和Benazepril后显著降低了大鼠血清和心肌组织FFA水平(P＜0.01)。
心肌组织Cpt-1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织Cpt-1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达量显著下调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠心肌组织Cpt-1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达量显著上调(P＜0.05)。
心肌组织PPARα、PGC-1αmRNA及蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织PPARα、PGC-1αmRNA及蛋白表达量显著下调(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠心肌组织PPARα、PGC-1αmRNA及蛋白表达量显著上调(P＜0.01)。
小结：
1.脉络学说认为营卫“由络以通，交会生化”，即营卫以气血之体，作流通之用，二者相偕而行，在脉络末端之孙络会和聚集，进行气、血、津液等物质转化及能量代谢。慢性心衰“营卫交会生化”异常是以微血管内皮细胞为核心和启动因素、神经体液调节与血液成分共同参与、心肌细胞功能结构损伤的复杂病理过程，导致气、血、水等物质转化及能量代谢异常，形成络息心积，揭示了慢性心衰能量代谢障碍的病理特点。
2.心梗后慢性心衰病理进程中脂肪酸利用率降低，FFA堆积，线粒体氧化呼吸功能受损，ATP生成减少。芪苈强心胶囊可能通过激活PPARα/PGC-1α信号通路上调慢性心衰大鼠脂肪酸β氧化关键酶Cpt1、MCAD、LCADmRNA及蛋白表达水平，降低血清及心肌组织FFA含量，优化脂肪酸利用，升高心肌组织线粒体RCR及MMP水平，促进ATP生成，改善慢性心衰大鼠心脏能量代谢。
第三部分芪苈强心胶囊对氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的作用及机制研究
目的：通过动物实验和细胞实验探讨芪苈强心胶囊对氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的作用及机制。
方法：
心梗后慢性心衰大鼠实验动物和分组给药方法同前。利用ELISA及荧光法检测各组大鼠血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放水平、活性氧(reactive oxygen species, ROS)表达水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性；TUNEL检测心肌细胞凋亡率，Westernblot方法检测线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3及信号通路相关指标AKT、p-AKT、糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylatedglycogensynthasekinase-3β,p-GSK3β)蛋白表达水平。
细胞实验体外培养大鼠H9c2心肌细胞，暴露于H2O2中建立氧化应激损伤模型。使用MTS评价QLQX、H2O2和QLQX在H2O2损伤基础上对H9c2心肌细胞生存活性的影响。实验分为Normal组，H2O2组，H2O2+QLQX组，采用ELISA及荧光法检测各组细胞LDH释放水平、胞内ROS表达水平，SOD活性；QRT-PCR法检测细胞血红素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)、过氧化氢酶(catalase, CAT)mRNA表达水平。给予PI3K抑制剂LY294002后，流式细胞仪测各组细胞凋亡率，WesternBlot测线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Cytochromec、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3表达水平及信号通路AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表达水平。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态，WesternBlot测线粒体分裂指标磷酸化动力相关蛋白1(phosphorylated dynamin-related protein 1,p-Drp1)、动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)蛋白表达水平；流式细胞仪检测各组细胞线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放情况，荧光法分析各组细胞MMP水平。
结果：
1.揭示芪苈强心胶囊对心梗后慢性心力衰竭大鼠氧化应激损伤心肌细胞线粒体结构和功能的作用
血清LDH释放水平、ROS表达水平和SOD活性结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠血清LDH释放水平、ROS表达水平显著升高(P＜0.01)，SOD活性显著降低(P＜0.01)；与Model组比较，QLQX组和Benazepril组大鼠血清LDH释放水平、ROS表达水平显著降低(P＜0.05)，SOD活性明显升高(P＜0.05)。
心肌细胞凋亡率结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌细胞凋亡明显增多(P＜0.01)；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后均不同程度抑制了心衰大鼠心肌细胞凋亡(P＜0.01)。
心肌组织线粒体途径凋亡蛋白表达结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3表达量显著上调(P＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著下调；与Model组比较，给予QLQX和Benazepril后下调了上述促凋亡蛋白表达量，上调了Bcl-2蛋白表达水平(P＜0.01)。
p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比率结果显示，与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比下调(P＜0.01)；给予QLQX和Benazepril后上调了p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比率(P＜0.05)。
2.揭示芪苈强心胶囊对H2O2损伤H9c2心肌细胞线粒体结构和功能的作用及机制
细胞生存活性结果显示，与Normal组相比，80μMH2O2损伤H9c2心肌细胞24h后生存活性降低至70.44%±3.81%(P＜0.01)适合做为造模浓度。QLQX作用H9c2心肌细胞24h后在＜200μg/mL范围内无细胞毒性。与H2O2组相比，QLQX作用H2O2损伤H9c2心肌细胞24h后，在90μg/mL浓度时促进了细胞增殖(P＜0.01)，因此确定该浓度为药物浓度。
LDH释放水平、ROS相对表达水平、SOD活性、HO-1和CATmRNA相对表达水平结果显示，与Normal组比较，H2O2损伤H9c2细胞24hLDH释放水平、ROS相对表达水平升高(P＜0.01)，SOD活性、HO-1和CATmRNA相对表达量降低(P＜0.01)；与H2O2组比较，给予QLQX后抑制了H2O2损伤H9c2细胞LDH释放水平、ROS相对表达水平，升高了SOD活性、HO-1和CATmRNA相对表达水平(P＜0.01)。
线粒体途径细胞凋亡结果显示，与Normal组比较，H2O2组H9c2细胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax，Cytochromec，Apaf-1，Cleaved-caspase9，Cleaved-caspase3表达水平显著升高(P＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低(P＜0.01)；与H2O2组比较，给予QLQX后显著降低了H2O2损伤H9c2细胞凋亡率及Bax，Cytochromec，Apaf-1，Cleaved-caspase9，Cleaved-caspase3蛋白表达水平(P＜0.01)，升高了Bcl-2蛋白表达水平(P＜0.01)；与H2O2+QLQX组比，给予PI3K抑制剂LY294002后部分扭转了QLQX组细胞凋亡率及线粒体途径凋亡蛋白表达趋势(P＜0.05)，且给予H2O2损伤H9c2细胞LY294002与H2O2组细胞凋亡情况相比无统计学差异。
p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比结果显示，与Normal组比较，H2O2组细胞p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比明显下调(P＜0.01)；与H2O2组比较，给予QLQX后上调了H2O2损伤H9c2细胞p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β蛋白表达比(P＜0.01)；与H2O2+QLQX组比，给予LY294002后部分扭转了上述指标趋势(P＜0.01)；且给予H2O2损伤H9c2细胞LY294002与H2O2组细胞相比上述指标无统计学差异。
线粒体分裂，mPTP开放情况，MMP水平结果显示，与Normal组相比，H2O2组细胞线粒体分裂，mPTP开放，MMP下降(P＜0.01)；与H2O2组相比，给予QLQX后抑制了线粒体分裂，mPTP开放及MMP下降(P＜0.01)；与H2O2+QLQX组比，给予LY294002后部分扭转了QLQX抑制线粒体分裂，mPTP开放、MMP下降的作用(P＜0.05)；且给予H2O2损伤H9c2细胞LY294002与H2O2组细胞相比上述指标无统计学差异。
小结：
1.心梗后慢性心衰大鼠氧化应激损伤，心肌细胞线粒体结构和功能障碍，触发线粒体途径细胞凋亡。芪苈强心胶囊可通过PI3K/AKT/GSK3β通路延缓慢性心衰大鼠氧化应激损伤，抑制线粒体途径细胞凋亡，改善心肌细胞线粒体结构和功能。
2.H2O2诱导大鼠H9c2心肌细胞氧化应激损伤，线粒体结构和功能障碍，触发线粒体途径细胞凋亡。芪苈强心胶囊可通过PI3K/AKT/GSK3β通路抑制H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化应激损伤、线粒体分裂、mPTP开放、MMP下降及线粒体途径细胞凋亡，改善心肌细胞线粒体结构和功能。
结论：
1.脉络学说指出慢性心衰“气阳虚乏，络瘀水停，络息心积”病机特点，卫阳不足，温煦失司，运化失权，营卫交会生化异常，气、血、水三者互患形成恶性病理循环，引起络息心积；提出慢性心衰营卫“交会生化”异常是以微血管内皮细胞为核心和启动因素、神经体液调节与血液成分共同参与、心肌细胞结构功能损伤的复杂病理过程，揭示了慢性心衰能量代谢障碍的病理特点。本研究利用心梗后慢性心衰大鼠模型证明了心脏能量代谢异常是慢性心衰的重要病理生理学基础，利用H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型证明ROS通过损伤心肌细胞线粒体结构和功能引起心脏能量代谢障碍。
2.基于上述病机特点提出“气血水同治分消”治疗原则，确立“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法，并研制了芪苈强心胶囊。本研究利用心梗后慢性心衰大鼠和H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型，揭示了芪苈强心胶囊通过抑制氧化应激损伤改善心肌细胞线粒体结构和功能，优化脂肪酸利用改善心脏能量代谢，从而进一步减轻心肌纤维化，改善心功能，阐明了芪苈强心胶囊可通过调控能量代谢延缓慢性心衰进程。这为中医脉络学说指导慢性心衰防治理论提供了数据支撑，同时为这类疾病治疗开辟新的途径。