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本论文由三部分工作内容组成:
第一部分为DNA旋转酶B结构域的晶体结构解析与功能研究。
DNA旋转酶是原核生物细胞体系中不可缺少的,对细胞生存极为重要的蛋白分子功能聚集体。作为ⅡA类拓扑异构酶的一种,它能够催化一条双链DNA(G-segment)的断裂,使另一条双链DNA(T-segment)穿过这个断裂口,然后重新连接G-segment,从而完成了一轮改变DNA的超螺旋数的反应。经过了三十多年的研究,构成酶分子核心部位的GyrB’是DNA旋转酶的四个基本的功能单位中唯一没有三维结构报道的部分。GyrB’结构的解析对于DNA旋转酶全酶分子构造及其反应的核心机制的研究有重要意义。本文报道来源于结核分支杆菌,分辨率为2.8埃的GyrB’晶体结构。结构显示,GyrB显示出一个独特的蟹状二聚体的分子形貌。经过对已有的结构分析发现,犹如“钳子”的tail domain和组成蟹体的toprim domain可能分别结合双链DNA T-segment和G-segment;在反应过程中,传递T-segment的Tail-钳子可能在GyrBC端的43残基的肽段调节下发生构象变化,产生“开”与“合”两种状态,以适应功能反应的结构需求。在此基础上,我们构建了DNA旋转酶反应初始状态的全酶结构,提出了T-segment通过GyrB’“导航”传递实现与G-segment交叉产生DNA超螺旋的可能结构机理。对了解这一复杂的酶反应机制建立了新的结构基础,提供了新的认识。
本论文的第二部分为泛素连接酶Cu13-SPOP蛋白复合物的表达,纯化,结晶及数据处理的过程。Cu13-SPOP属于依赖于泛素的降解途径中泛素连接酶E3最主要的RING family的重要成员,在胞内特异性介导多种调控蛋白的泛素化降解来调节细胞的生物学进程,如减数分裂向有丝分裂期的转变等。Cu13-SPOP的晶体结构解析将对其功能特异性的研究有重要意义。此复合物经过长期的优化已在多种条件下得到晶体,但衍射力还有待提高,期待通过进一步的工作能有所突破。
第三部分工作内容为痢疾杆菌谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白(sfEBP)的底物结合性质研究。通过对DEBP的变复性操作成功制备了此蛋白的Ligand free样品,并测定了DEBP的底物结合性质,证实了DEBP极强的底物结合特异性。