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背景:丙泊酚和氯胺酮是临床常用的非巴比妥类麻醉剂,异丙酚是γ-氨基丁酸A亚型受体(γ-aminobutyric acid,GABA)激动剂,并抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体;氯胺酮是非竞争性NMDA受体阻断剂。丙泊酚因为能够降低脑血流(cerebralbloodflow,CBF),减少脑氧耗(cerebral metabolic rate for O2,CMRO2),降低颅内压(intracranial pressure,ICP)被认为有一定的脑保护作用,但其确切的脑保护机制尚不明确。与丙泊酚相反,氯胺酮增加脑血流、颅内压、脑氧耗,很长时间内被禁用于脑缺血颅脑损伤患者,但最近的研究表明在缺血性脑损伤中氯胺酮也表现出潜在的脑保护作用。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)是一种核转录因子,可被其上游多种激酶激活,触发丝氨酸133位点的快速磷酸化,P-CREB调节其下游抗凋亡因子、神经营养因子的表达,参与脑缺血损伤的保护机制。
目的:探讨不同剂量的丙泊酚和氯胺酮在小鼠永久性大脑中动脉栓塞模型fmiddle cerebral artery occlusion,MCAO)形成的大脑缺血损伤中的脑保护作用与CREB及其上游激酶CaMKII在其中的作用。
方法:160只成年雄性BALB/c小鼠(体重18-22g)随机分成8组:假手术组(Sham);MCAO+生理盐水组;MCAO+25,50,100mg/kg丙泊酚组;MCAO+25,50,100mg/kg氯胺酮组。各组术后30分钟经腹腔注射0.2ml生理盐水或是等体积生理盐水稀释的丙泊酚或是氯胺酮。6h后双盲进行行为学评分,断头取脑,行TTC染色,测算脑水肿率、梗死体积评价小鼠缺血性脑损伤程度。取大脑皮层收集缺血核心区(Ischemia,I)、半影区(Penumbra,P)和对侧皮质(Contralateralcortext,C)组织,进行全细胞组分的提取,应用10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsutfonate-polyacrylate gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot技术及GelDoc凝胶成像半定量系统检测三个脑区T-CREB、P-CREB和T-CaMKII、P-CaMKII水平。各组小鼠手术6h后用4%多聚甲醛灌注,经后固定脱水后用冰冻切片机将大脑切成40μm的脑片,通过免疫荧光双标在共聚焦显微镜下观察P-CREB阳性细胞与神经元核特异性标记物NeuN(neuron-specific nuclear marker,NeuN)的共定位情况。
结果:研究发现与MCAO+生理盐水组相比50,100mg/kg丙泊酚+MCAO组,25mg/kg氯胺酮+MCAO组能显著性减小神经缺陷评分,水肿率,梗死体积(n=10,P＜0.05);抑制半影区P-CREB水平的降低。25mg/kg氯胺酮+MCAO组半影区P-CaMKII水平升高(n=6,P＜0.05),而任何剂量的丙泊酚对半影区P-CaMKII无影响(n=6,P＞0.05)。另外,荧光双标染色结果显示P-CREB阳性细胞和神经元核特异性标记物NeuN共定位(n=4)。对半影区阳性细胞进行计数结采显示:50,100mg/kg丙泊酚+MCAO组,25mg/kg氯胺酮+MCAO组皮层半影区阳性细胞计数显著性增加(n-4,P＜0.05)。
结论:在6hMCAO缺血损伤模型中抑制半影区神经元特异性P-CREB减少可能参与大剂量组丙泊酚和小剂量组氧胺酮的脑保护机制,其上游激酶CaMKII可能参与氯胺酮而非丙泊酚的脑保护机制。