【摘 要】
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棉花在世界经济作物中有着举足轻重的地位。而纤维作为棉花的主要产出,对纺织业的发展有着不可忽视的贡献。棉花纤维发育包括5个阶段,即纤维细胞突起、伸长、转换、次生壁加厚以及脱水,每个阶段都有其相应的基因调控网络。其中纤维起始阶段的细胞分化直接关系到成熟纤维的品质和产量,是目前研究的热点之一。本实验室为解析纤维起始相关调控网络,筛选出一系列在纤维起始期高量表达的转录因子（TFs）,其中包括一个R2R3-
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棉花在世界经济作物中有着举足轻重的地位。而纤维作为棉花的主要产出,对纺织业的发展有着不可忽视的贡献。棉花纤维发育包括5个阶段,即纤维细胞突起、伸长、转换、次生壁加厚以及脱水,每个阶段都有其相应的基因调控网络。其中纤维起始阶段的细胞分化直接关系到成熟纤维的品质和产量,是目前研究的热点之一。本实验室为解析纤维起始相关调控网络,筛选出一系列在纤维起始期高量表达的转录因子（TFs）,其中包括一个R2R3-MYB类TF GhWER。利用CRISPR/Cas9技术对GhWER进行定向敲除,结合敲除系的表型和相关分子实验技术,解析GhWER在纤维发育中的调控路径,完善纤维起始相关基因调控网络。主要结果如下:1.陆地棉基因GhWER与拟南芥表皮毛发育相关基因At WER的序列相似性最高,两者所编码的蛋白在R2R3-MYB结构域上的相似性达70%。GhWER在-1.5 DPA（开花前1天半）的胚珠中就开始高量表达,在-1 DPA时达到最高,之后开始逐渐降低。且本实验室表达谱数据表明,相对于陆地棉其它同源基因,GhWER在纤维起始时期的胚珠中的表达量最高。2.根据GhWER基因组序列设计靶向R2R3-MYB结构域的CRISPR/Cas9双靶点基因编辑载体,转化棉花,获得13株T0植株。利用Hi-TOM和Sanger测序技术检测了转基因棉花T0、T1、T2代每个株系所有单株的编辑情况,发现每个单株至少有一个靶标被编辑,且能稳定的遗传给后代。相对野生型,GhWER敲除系（GhwerCR）的纤维起始及早期伸长受到抑制,导致成熟纤维显著变短。3.TFs一般会和其它蛋白互作来调控基因的表达,因此首先在自激活检测实验中确定了GhWER蛋白的自激活域位于第191～230位氨基酸处,然后利用截短的GhWERN2蛋白进行酵母双杂交实验筛选互作蛋白。在纤维起始相关的TFs库中筛选到两个互作TFs GhDEL65和GhbHLH121,两者都是bHLH类TFs,且在纤维发育起始期高量表达,说明GhWER可能以MYB/bHLH复合物的形式调控纤维发育。4.为了进一步研究GhWER下游基因调控网络,对GhWER敲除株系和野生型的-1.5 DPA胚珠表皮进行转录组测序（RNA-seq）,以表达差异大于2倍作为筛选标准,共获得241个差异表达基因（DEGs）,采用GO和KEGG富集的方法分析这些DEGs所参与的调控路径,发现其主要富集在激素信号传导和刺激响应相关路径上,其中乙烯（Eth）合成相关基因ACS1、Eth受体基因RAV1和ETR2、Eth响应相关基因ERF017、生长素（IAA）响应基因SAUR50、赤霉素（GA）调节基因SN2和GASA14等都在GhWER敲除株系中下调表达,表明GhWER可能是通过促进调控Eth、IAA以及GA的信号转导来正向调控纤维的起始和早期伸长。
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