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本论文旨在实验室提供金属硫蛋白(MT)基因工程菌株的基础上，通过诱导重组质粒表达融合蛋白，然后用ChelatingSepharoseFastFlow亲合层析柱对重组金属硫蛋白(rMT)进行分离纯化，改进并简化rMT的纯化工艺，以获得纯的MT融合蛋白。在此基础上，通过建立沙土鼠全脑缺血再灌注模型，观察腹腔注射rMT对蒙古沙土鼠缺血再灌注脑组织中抗氧化指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(s0D)、谷胱甘肽(GSH)含量的影响及对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的影响，探讨rMT是否对缺血再灌注脑损伤具有保护作用，为缺血性脑损伤的保护性治疗提供实际并有应用价值的药物，并探索其可能的作用机制。
本论文由二部分实验组成。实验一是蟹类重组金属硫蛋白诱导表达及其纯化：用LB液体培养基常规培养BL21，分别改变葡萄糖浓度、培养时间、IPTG浓度、诱导时间和诱导温度，对工程菌株进行诱导表达，SDS—PAGE电泳检测rMT在细菌中的表达情况。然后，利用rMT上的6His(组氨酸)能与多种过渡金属螯合物结合及MT能螯合金属离子的特性，采用Zn-ChelatingSe曲arose亲合层析并用咪唑及EDTA溶液洗脱结合的rMT，最后纯化得到rMT。实验二是蟹类重组金属硫蛋白对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的作用及机理研究：阻断沙土鼠双侧颈总动脉15min造成全脑缺血模型。将90只沙土鼠随机分为假手术组，脑缺血再灌注损伤组(对照组)，重组MT处理组(MT组)，根据再灌注不同时间(4h、1d、3d、5d、7d)将每组各分五个亚组(n=6)。于再灌注各时间点，断头取脑测定脑组织匀浆中SOD活性和GSH、MDA的含量，并制成石蜡切片，分别进行TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色。
结果显示：1)通过诱导重组质粒表达制备了融合蛋白，用ChelatingSepharoseFastFlow亲合层析柱对rMT进行分离纯化，改进并简化了rMT的纯化工艺，获得了MT的融合蛋白。其中，在葡萄糖浓度为3％、OD值范围为0．3-1．5的培养条件下，诱导剂IPTG的浓度为lmm、诱导温度为37~C，诱导表达3h时，可获得目的蛋白的最高表达量。在选用Zn-ChelatingSe曲arose亲合层析时采用常规低浓度咪唑(10~300mmol／L)洗脱，部分融合蛋白可以洗脱下来，接着再用EDTA洗脱液把另外一部分融合蛋白完全洗脱。上述结果说明MT纯化时，不仅融合蛋白上的6His和填料上的Zn2+结合，同时由于金属硫蛋白具有强螯合金属的特性而使部分蛋白与Zn2+结合，最后用EDTA溶液洗脱而获得了含锌的融合蛋白，可用于下一步的功能研究。2)氧自由基增加所导致的氧化损伤及氧化与抗氧化失衡直接参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程。rMT对SOD活性及MDA含量影响不大，但可以增加GSH含量抗氧自由基，在一定程度上恢复损伤组织氧化与抗氧化平衡，对脑缺血再灌注氧化损伤可能具有保护作用。在沙土鼠对照组中，各时相SOD活性及GSH含量明显降低，MDA含量明显升高，与假手术组比较均相差显著(<0．05)。在MT组中，几乎各时相GSH含量都较对照组升高(P<0．05)，但SOD活性及MDA含量变化不明显，与对照组比较相差不显著(P＞0．05)。3)沙土鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡的存在。MT对沙土鼠全脑缺血再灌注后海马CAl区细胞凋亡的作用呈时间依赖性，可以减轻第5d、7d神经细胞凋亡的发生，但不能减轻第1d、3d细胞凋亡的发生。在对照组中再灌注后第3d、5d海马CAl区TUNEL染色及caspase-3免疫组化染色阳性数目明显增多，第7d有所减少。假手术组海马CAl区可见少量TUNEL染色及caspase-3免疫组化染色阳性细胞，对照组及MT组沙土鼠的海马CAl区中，TUNEL染色及caspase-3免疫组化染色阳性计数明显增多，与假手术组比较差异具统计学意义(P<0．05)，但MT组TUNEL染色及caspase-3免疫组化染色阳性细胞数目在第5d、7d时明显低于对照组(P<0．05)。
以上结果提示，蟹类重组金属硫蛋白对沙土鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其机理可能是通过提高细胞的抗氧化和抗凋亡作用。但是由于血脑屏障的存在可能会影响MT对脑缺血再灌注损伤的治疗作用，推测MT可能对其它器官的缺血再灌注损伤治疗作用更明显。