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金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类广泛存在于生物体内的分子量小、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。其结构决定了它极有效的螯合金属离子和清除自由基的功能，因而在抗氧化方面有广泛的应用前景。目前，该蛋白的制备和纯化的主要来源是动物内脏，除了有内源毒素的隐患这一缺陷外，蛋白的得率更是受到限制。因此，目前市场上该蛋白的价格不菲，除了用于研究外，很难能真正得到广泛而实际的应用。本课题组基于以上的原因，从四种蟹中筛选了中华绒螯蟹的MT基因，通过基因克隆技术建立了该蛋白的原核表达系统，诱导其大量表达，纯化获得较高纯度的重组MT产物。并从非细胞系方法和体外细胞培养两个方向研究我们克隆表达的MT的作用。
本实验在前期实验结果的基础上，利用向液体培养基中加入不同浓度的Zn2+、Cu2+，对带有MT基因的工程菌进行诱导表达，并通过对Cd2+、pb2+分别进行10μM、30μM、60μM、90μM、100μM、120μM、150μM、200μM以及300μM、200μM、100μM．50μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0．5μM、0．05μM、0．01μM等一系列浓度的摸索，观察这两种离子对蛋白表达的诱导影响，寻找这两种离子的最佳添加浓度。然后将诱导表达后处理产物通过ChelatingSepharoseFastFlow亲和层析柱，层析柱中采用SuperChelatingResin填料，分别以Zn2+、Cu2+、Cd2+、pb2+为配基进行亲和层析，再分别将上一步添加了相应的金属离子进行诱导表达的工程菌上清液过柱，得到纯度较大的融合了四种不同二价离子的重组MT。并分别以SDS—PAGE和紫外吸收光谱分析鉴定和分析了获得的蛋白。为分析重组MT纯化物的自由基和过氧化物的清除效应，进行了非细胞系统的自由基清除能力的测定，同时也对细胞色素C法和荧光光谱测定法进行了比较。
为了了解MT在细胞体系内的抗氧化作用，本实验还进行了体外细胞水平的研究。利用H202作为自由基诱导剂和纯化后经过膜透析的不同浓度的重组MT融合蛋白一起以药物的形式添加入细胞培液中，经过18～24h的培养后，收集细胞和胞液，检测了细胞中超氧化物歧化酶(SuperOxideDismutaseSOD)活力，谷胱甘肽过氧化物酶(GlutathionePeroxidaseGSH-PX)活力和丙二醛(MaleicDialdehydeMDA)的量以及胞液中乳酸脱氢酶(LactatedehydrogenaseLDH)的渗出率等四个抗氧化指标。
结果表明：
1、通过Zn2+、Ca2+、Cd2+、pb2+四种离子的添加对诱导效果影响的比较，可以观察到：四种离子的添加均能有效的促进MT的表达，通过对Cd2+、pb2+的添加浓度摸索，认为在本实验条件下，二者的适宜添加量分别为120ltm和lgM。其中Zn2+、Cu2+、Cd2+三种离子的添加对于MT的诱导效果影响较为理想，相对比较适宜于本实验的要求，而pb2+对MT的表达的促进作用不如其他三种离子，因此在本实验条件下不是理想的离子添加物。
2、在通过层析柱纯化过程中，Zn2+、Cu2+、Cd2+三种离子易溶于水，是较好的螯合配基，能够有效地分别得到螯合了三种离子MT融合蛋白。而pb2+由于难溶于水，因此在对层析柱填料进行激活洗脱过程中难以有效的螯合在填料中，无法有效而大量地获得高纯度螯合了pb2+的MT。
3、通过紫外吸收光谱分析，得到的螯合了三种不同离子的MT融合蛋白在其特定的紫外吸收波长处有明显的特征波峰，从而可以确定通过这种方法能够有效获得较大量的MT。
4、在非细胞系统中，MT具有强大的自由基清除作用，在一定浓度范围内呈正相关。将其与GSH对照，发现：三种蛋白的清除效果均显著高于GSH，其中CdMT和ZnMT的清除效果相差不大，其清除效果大大高于GSH，而CuMT的清除效果明显减弱，但仍然极大的高于GSH。证明是一种高效的自由基清除剂。
5、在体外细胞体系中，ZnMT表现出一定的抗氧化作用，对细胞的SOD、GSH-PX、MDA、LDH渗出率四个指标进行了检测，发现ZnMT的作用主要表现在改善了细胞的体液外环境，从而对细胞的生长状态起保护作用。