论文部分内容阅读
卵巢癌是三大妇科恶性肿瘤中的“头号杀手”。除了手术，化疗是其重要的治疗手段，但卵巢癌的化疗耐药尤其是多药耐药是导致患者五年生存率停滞不前的主要原因。目前低氧微环境因素在肿瘤化疗耐药中的作用备受瞩目。低氧诱导因子(HIF-l)是低氧诱导产生的最重要核转录因子之一，HIF-1α是HIF-1的关键的活性调控亚基，已发现在约70％实体瘤中高表达，而且与肿瘤放、化疗敏感性密切相关，探讨对HIF-1α的调控成为研究卵巢癌化疗耐药的热点。在常氧环境下，泛素—蛋白酶体途径是HIF-1α蛋白降解的主要方式，而在低氧环境下不能启动蛋白酶体降解途径，使得HIF-1α蛋白得以稳定下来调控下游靶基因，刺激肿瘤细胞血管生成、增殖和诱导化疗抵抗等生理过程。低氧是实体肿瘤无法改变的生存微环境，因此，若能实现在低氧环境下对HIF-1α的调控进而阻断肿瘤的恶性增殖、血管新生和逆转化疗耐药将具有非常重要的临床意义。新近发现的SUMO特异性蛋白酶1（sumo—specific protease1,SENP1），不需分子氧作为底物即可使HIF-1α发生去SUMO化修饰，调控HIF-1α的蛋白稳定性及转录活性。由此假设通过调控SENP1可调节卵巢癌在低氧微环境下化疗的敏感性。本研究以人卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象，检测常氧及低氧条件下SENP1的表达对SKOV3顺铂化疗敏感性的影响，希望能为逆转卵巢癌的化疗耐药及靶向治疗提供理论基础。本文主要从以下几部分展开论述： 第一部分 低氧对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响 目的：探讨低氧对卵巢癌细胞株SKOV3化疗敏感性的影响。 方法：低氧诱导剂氯化钴CoCl2处理SKOV3细胞，CCK-8实验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率、western blotting检测HIF-1α蛋白表达水平以确认是否成功建立“有效低氧”。之后， SKOV3细胞分为常氧组和低氧组，梯度浓度顺铂作用后，CCK-8实验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果：200μM CoCl2可在72h内显著提高SKOV3细胞HIF-1α蛋白表达水平且对细胞存活率无明显影响；CCK-8实验结果显示顺铂显著抑制SKOV3细胞增殖能力（P<0.05）且该效应具有浓度依赖性和时间依赖性，该效应在常氧组较在低氧组显著（P<0.05）；流式细胞术结果显示低氧顺铂组细胞凋亡率较常氧顺铂组显著降低（P<0.05）。 结论：成功构建人卵巢癌细胞SKOV3的“有效低氧”；低氧能明显降低人卵巢癌细胞SKOV3对顺铂化疗的敏感性。 第二部分 上调SENP1基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响 目的：探讨上调SENP1基因低氧对卵巢癌细胞株SKOV3化疗敏感性的影响。 方法：用构建的过表达质粒SENP1（SENP1 plasmid）转染SKOV3细胞，Real-time PCR、western blotting、免疫荧光等检测转染效率。SKOV3细胞分为6组：常氧对照（N con）、常氧转空质粒（N Bp,Blank plasmid）、常氧转SENP1 plasmid(N plasmid)、低氧对照(H con)、低氧转空质粒(H Bp)、低氧转SENP1 plasmid(H plasmid),转染24h后胰酶消化收集细胞并重悬，种96孔板，每组细胞做3个复孔，贴壁后分别加40μM、60μM、80μM顺铂，常规培养48h后，CCK-8实验检测细胞存活率。SKOV3细胞分为上述6组，转染48h后分别加入60μM顺铂，常规培养48h后收集细胞，用流式细胞术检测凋亡率。SKOV3细胞分为上述6组，转染48h后分别加入60μM顺铂，常规培养48h后，western blotting检测凋亡相关蛋白BAX、PARP的变化。 结果：Real-time PCR、western blotting、免疫荧光分别显示转染SENP1质粒后SENP1的mRNA、蛋白水平、荧光强度均明显增加， SENP1质粒转染成功。转染SENP1质粒的SKOV3细胞存活率明显增加（P<0.05），低氧比常氧增加更明显(P<0.05）。转染SENP1质粒的SKOV3细胞凋亡率明显减少（P<0.05），低氧比常氧减少更明显（P<0.05）。转染SENP1质粒后再加顺铂处理，凋亡蛋白BAX、PARP均降低，低氧比常氧降低更明显。 结论：转染SENP1 plasmid可显著上调SENP1的表达。上调SENP1可降低SKOV3对顺铂化疗的敏感性，且此效应在低氧条件下更显著。 第三部分 抑制SENP1基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响 目的：探讨抑制SENP1基因低氧对卵巢癌细胞株SKOV3化疗敏感性的影响。 方法：用构建的siRNA SENP1转染SKOV3细胞，Real-time PCR、western blotting、免疫荧光等检测转染效率。SKOV3细胞分为6组：常氧对照（N con）、常氧转无效siRNA对照（N nc）、常氧转siRNA SENP1(N si)、低氧对照(H con)、低氧转无效siRNA对照(H nc)、低氧转siRNA SENP1(H si),转染24h后胰酶消化收集细胞并重悬，种96孔板，每组细胞做3个复孔，贴壁后分别加40μM、60μM、80μM顺铂，常规培养48h后，CCK-8实验检测细胞存活率。SKOV3细胞分为上述6组，转染48h后分别加入60μM顺铂，常规培养48h后收集细胞，用流式细胞术检测凋亡率。SKOV3细胞分为上述6组，转染48h后分别加入60μM顺铂，常规培养48h后，western blotting检测凋亡相关蛋白BAX、PARP的变化。 结果：Real-time PCR、western blotting、免疫荧光分别显示转染siRNA SENP1后SENP1 mRNA、蛋白水平、荧光强度均明显下降，siRNA SENP1转染成功。转染siRNA SENP1的SKOV3细胞存活率明显减少（P<0.05），低氧比常氧减少更明显（P<0.05）。转染siRNA SENP1的SKOV3细胞凋亡率明显增加（P<0.05），低氧比常氧增加更明显（P<0.05）。转染siRNA SENP1后再加顺铂处理，凋亡蛋白BAX、PARP均增加，低氧比常氧增加更明显。 结论：转染siRNA SENP1可显著抑制SENP1表达。抑制SENP1可增加SKOV3对顺铂化疗的敏感性，且此效应在低氧条件下更显著。 第四部分 SENP1基因对HIF-1α的调控作用 目的：检测常氧和低氧条件下SENP1对人卵巢癌细胞SKOV3中HIF-1α表达的影响。 方法：SKOV3细胞分Ncon、NBp、Nplasmid、Hcon、HBp、Hplasmid组及Ncon、Nnc、Nsi、Hcon、Hnc、Hsi组，转染24h后收集细胞，Real-time PCR检测HIF-1αmRNA水平的变化；转染48h后，western blotting、免疫荧光分别检测HIF-1α蛋白表达及荧光强度的变化。 结果：转染24h后，在上调SENP1和抑制SENP1表达的两组细胞中HIF-1αmRNA水平均无明显变化（P>0.05）。转染48h后，上调SENP1组HIF-1α蛋白表达明显增加，抑制SENP1组HIF-1α蛋白表达明显降低，改作用在低氧比常氧条件下更明显。转染48h后上调 SENP1组HIF-1α荧光强度明显增加，抑制SENP1组HIF-1α荧光强度明显降低，该作用在低氧比常氧条件下更明显。 结论：SENP1对HIF-1αmRNA水平无明显影响，上调SENP1可增加HIF-1α蛋白表达和荧光强度，而抑制SENP1可降低HIF-1α蛋白表达和荧光强度。SENP1对卵巢癌化疗耐药的影响可能是通过调控HIF-1α的表达来实现的。