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目的： 肺癌是世界上肿瘤相关死亡的最主要原因并且转移所导致的死亡占了绝大多数。近三分之二的患者在诊断时即处于晚期，并且部分患者尽管能够手术治疗，术后仍易复发进展。对转移的启动程序的掌控可能为临床预防或抑制转移提供重要治疗靶点。现普遍认为，上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是促使肿瘤细胞原位侵入和细胞转移的初始调控步骤，但目前尚未有能有效抑制EMT的药物。若能明确可以增强细胞粘附、抑制细胞骨架重建的蛋白，便有效抑制EMT的出现。Metaderin(MTDH)蛋白定位于上皮细胞紧密连接处，参与组成紧密连接复合物，是成熟的紧密连接的标志。但其与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的相关性目前尚不清楚。 本研究将通过临床标本、体外细胞实及体内整体水平明确MTDH与NSCLC之间的相关性，观察MTDH表达水平对NSCLC增殖和转移的关系，并探索其中可能机制，为肿瘤转移的早期诊断及有效治疗提供理论基础和分子靶点。 方法： 1.Trizol法提取手术切除NSCLC组织及对应正常肺组织的RNA，逆转录为eDNA，荧光定量PCR分别检测NSCLC组织及对应正常肺组织中MTDH及GAPDH水平。同时免疫组化方法检测NSCLC组织石蜡切片中MTDH的蛋白表达水平，并利用统计方法分析得出MTDH表达水平与NSCLC患者的临床病理特征及预后的相关性。 2.体外构建含MTDH全长蛋白编码序列的质粒MTDH-PCR3.1及特异性靶向MTDH的siRNA(siMTDH)。realtimePCR方法检测A549、H1299、H1650三株NSCLC细胞系的MTDH基础表达水平。MTDH表达较低的H1299细胞和H1650细胞转染表达增高质粒，MTDH基础水平较高的A549转染siRNA，qRT-PCR、Western-blot方法检测细胞中MTDH表达水平，验证提高及抑制效率。 3.MTDH表达外源性增高的NSCLC细胞和对照细胞利用MTT方法和免疫荧光检测EdU与细胞的DNA结合，双重验证MTDH表达对细胞增殖的影响。利用软琼脂集落形成实验，检测MTDH表达增高对非锚定依赖生长能力的作用。PI法检测细胞周期，探索MTDH表达增高影响增殖的可能原因。BALB/c裸鼠中构建皮下肿瘤模型，共24只小鼠，分为H1299 Control组和MTDH12组两个组，每只裸鼠皮下种植2×106个细胞，注射8周后观察肿瘤生长情况。根据每组成瘤小鼠数，计算成瘤率。测量肿瘤组织的最大径a及最小径b，根据体积=ab2/2，公式计算得出每组肿瘤的大小，并进行肿瘤组织重量的测量，最后统计分析。 4.划痕实验观察MTDH表达外源性增高的NSCLC细胞迁移能力的改变，并利用Matrigel基质胶有无的Transwell实验，观察细胞的迁移和侵袭能力。倒置显微镜观察细胞形态，F-actin及MTDH免疫荧光染色，判断MTDH表达增高后肌动蛋白细胞骨架有无改变。观察划痕6h后有无细胞迁移，并标记F-actin，观察促转移性肌动蛋白细胞骨架有无改变。Western blot明确MTDH表达增高后EMT相关标志蛋白改变。另一方面，划痕实验观察MTDH表达抑制后的A549细胞迁移能力的改变。观察细胞形态的改变和Western blot检测EMT标志蛋白表达，与TGF-β的阳性对照进行比较。BALB/c裸鼠尾静脉注射细胞构建NSCLC全身转移模型（5×106个细胞/只，共10只小鼠，分H1299 Control组和MTDH12组），注射12周后观察肺内结节、淋巴结转移有无、胸腔积液有无等全身转移情况。 结果： 1.MTDH表达水平在NSCLC组织中较正常对照组织降低，并且与NSCLC淋巴结转移、TNM分期及预后具有明显相关性:在38对NSCLC组织及对应正常肺组织中，35对NSCLC组织MTDH mRNA表达水平较正常组织的降低，平均表达水平为0.363±0.091。免疫组化结果同样提示与良性假瘤相比，NSCLC组织的MTDH蛋白表达水平降低。 进一步分析发现26位无淋巴结转移患者的MTDH mRNA水平较12位淋巴转移患者高(P=0.0256)。根据免疫组化的染色强度和范围，将NSCLC患者分为MTDH高表达组和低表达组。MTDH表达与淋巴结转移及TNM分期具有明显相关性(P=0.003和P=0.016)。MTDH低表达组患者中位总生存期为558天而MTDH高表达组患者为642天(P=0.022)，提示MTDH表达低的患者预后不佳。 2.MTDH表达增高可抑制NSCLC细胞增殖及肿瘤成瘤性:经过mRNA和蛋白验证，选择增高较低的H1299 MTDH5(M5)和H1650 MTDH1(M1)及增高较高的H1299 MTDH12(M12)和H1650 MTDH2(M2)。 MTT实验结果显示与对照细胞相比，MTDH表达增高细胞的增殖速度减慢(P＜0.05)。Edu与细胞DNA的结合比率在H1299 M12细胞及H1650 M2细胞均明显减低(P=0.0002和P=0.0011)。软琼脂实验中MTDH表达增高细胞无论是克隆数目还是克隆集落的大小均较低(P＜0.01)。H1650细胞的细胞增殖周期结果提示与对照细胞相比，MTDH表达增高细胞明显细胞周期阻滞，增殖速率变慢(P＜0.001)。 8周后MTDH表达增高组的体内成瘤率较Control细胞组明显降低。并且H1299 M12组肿瘤结节大小较小（0.667cm3 vs1.208cm3，P=0.0083），肿瘤重量也较轻(0.465g vs0.246g，P=0.0456)。 3.MTDH表达改变可调控NSCLC细胞促转移性肌动蛋白细胞骨架重塑从而调节NSCLC细胞转移:划痕后10h和24h，均表现为MTDH表达增高的H1299细胞的迁移能力明显低于Control细胞(P＜0.001)。而Transwell实验结果显示，与Control细胞相比，H1299和H1650 MTDH表达增高细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均明显减少(P＜0.01)，提示MTDH表达增高后可抑制NSCLC细胞迁移和侵袭。 倒置显微镜下观察到Control细胞本身形态接近间质细胞样为变形或细长并纺锤形，而与之相比MTDH表达增高细胞多呈典型的上皮细胞多边形结构。免疫荧光显示，对照细胞具有明显的丝状伪足或张力纤维聚集，而MTDH表达增高后则细胞间粘附紧密并无明显张力纤维聚集。划痕后6h，Control细胞已见明显变形边长的细胞向划痕迁移覆盖，而MTDH表达增高细胞尚未见明显迁移细胞。Control细胞迁移前端细胞骨架为促转移性间质型细长纺锤状或丝状伪足丰富结构，而MTDH表达增高后该表现消失。迁移前端细胞大小测量结果表现为MTDH表达增高后，细胞面积增大(P＜0.01)。Western Blot检测显示上皮标志蛋白随MTDH表达增高而增高，而间质标志蛋白则减低。 MTDH表达降低的A549细胞迁移速度较对照细胞明显增加。A549 siMTDH细胞形态表现为由典型的多边形上皮细胞形态转变为细长、纺锤型间质细胞样，且细胞粘附减少;该细胞形态改变与TGF-β刺激后相似。相应EMT标志蛋白检测结果也表现为E-cadherin表达下降而Vimentin表达增高，与TGF-β刺激后相似，并且TGF-β刺激后MTDH表达下降。 H1299 Control组与M12组BALB/c裸鼠的体表肿大淋巴结存在明显不同，Control组5个肿大淋巴结，平均大小为55.7mm3，而M12组仅2个肿大淋巴结，平均大小为9.86 mm3(P=0.0007)。此外，Control组5只小鼠中有4只存在血性胸腔积液，体积范围200ul-2000ul，而M12组仅1只有少量约100ul的血性胸腔积液。 结论： 1.MTDH是预测NSCLC患者转移及预后的重要因子:临床标本检测提示MTDH表达与NSCLC患者淋巴结转移、TNM分期及预后相关，表达降低是转移及预后不良的重要预测因子。 2.MTDH的抗NSCLC细胞增殖及成瘤性功能: MTDH表达增高后体外能通过细胞增殖周期阻滞从而抑制NSCLC细胞增殖，并降低肿瘤细胞的非依赖贴壁生长的能力;体内明显降低NSCLC细胞成瘤性，并抑制皮下种植肿瘤的生长; 3.MTDH的抗NSCLC细胞转移的功能:MTDH表达增高后细胞迁移及侵袭能力都明显降低;主要机制可能是逆转细胞促转移性肌动蛋白细胞骨架重塑，逆转细胞EMT; MTDH降低表达后细胞表现为EMT，与TGF-β刺激后相似，进一步证实MTDH的抗EMT抗转移的功能;体内实验证实MTDH表达增高后转移淋巴结明显减少并淋巴结大小明显减小，血性胸腔积液的发生也明显降低。 4.提高MTDH水平可同时发挥抑制NSCLC细胞增殖、成瘤性及转移的功能，并且MTDH是临床NSCLC患者提示转移和预后的重要因子。这为NSCLC的早期转移的诊断提供新的工具，并对抑制转移的有效治疗提供新的靶点，为临床治疗提供理论基础，具有临床转化和产业化前景。