论文部分内容阅读
目的： 本研究利用蛋白芯片技术探讨食管癌病人与正常人血清中差异蛋白的表达，筛选不同证候食管癌血清中的差异表达蛋白。并探讨清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞增殖及其相关分泌蛋白的调节作用，为食管癌中医证候分子病机的阐释以及食管癌的诊断和治疗提供可靠的依据。 方法： 1.建立食管癌血清标本库及与其对应的食管癌患者临床资料数据库，筛选其中严格配对的21例食管癌患者血清，并筛选出与之配对的7例正常人血清； 2.运用抗体芯片 AAH-BLG-1（含507种细胞重要功能蛋白）筛选食管癌患者与正常人血清中差异表达的蛋白质，对比食管癌患者与正常对照、痰气交阻型（ P）患者组与正常对照、津亏热结型（ F）患者组与正常对照、瘀血内结型（ B）患者组与正常对照、气虚阳微型（ Q）患者组与正常对照、津亏热结型（ F）患者组与痰气交阻型（ P）患者组、瘀血内结型（ B）患者组与津亏热结型（ F）患者组、瘀血内结型（ B）患者组与气虚阳微型（ Q）患者组、瘀血内结型（ B）患者组与痰气交阻型（ P）患者组、津亏热结型（ F）患者组与气虚阳微型（ Q）患者组、气虚阳微型（ Q）患者组与痰气交阻型（ P）患者组共11组差异表达蛋白的情况。 3.根据上述11组差异表达蛋白分析蛋白的主要功能和参与的信号转导通路。 4.运用 MTT法检测清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞 Eca109、EC9706、TE-1和 EC-1细胞增殖活性的影响； 5.运用流式细胞术分析清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞 Eca109、EC9706、TE-1和 EC-1细胞周期的影响； 6.运用 western blot分析清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞 Eca109、EC9706、TE-1和 EC-1中 MMP1、MMP14、OPG、FBLN5和 PECAM-1表达的影响。 结果： 1.食管癌患者组与正常对照组共存在37个差异表达蛋白；痰气交阻型（ P）患者与正常对照共存在100个差异表达蛋白；津亏热结型（ F）患者组与正常对照共存在22个差异表达蛋白；瘀血内结型（ B）患者组与正常对照共存在16个差异表达的蛋白；气虚阳微型（ Q）患者组与正常对照共存在25个差异表达的蛋白；津亏热结型（ F）患者组与痰气交阻型（ P）患者组共存在29个差异表达的蛋白；瘀血内结型（ B）患者组与津亏热结型（ F）患者组共存在6个差异表达的蛋白；瘀血内结型（ B）患者组与气虚阳微型（ Q）患者组共存在14个差异表达的蛋白；瘀血内结型（ B）患者组与痰气交阻型（ P）患者组共存在8个差异表达的蛋白；津亏热结型（ F）患者组与气虚阳微型（ Q）患者组共存在7个差异表达的蛋白；气虚阳微型（ Q）患者组与痰气交阻型（ P）患者组共存在31个差异表达的蛋白。 2.对筛选出的差异蛋白进行 GO分类，食管癌病人与正常对照组差异主要分子功能为促进 M PA K级联途径和白细胞迁移；痰气交阻型与正常对照组差异蛋白主要与促进细胞的运动及迁移相关；津亏热结型与正常对照组差异蛋白主要与细胞黏附、T细胞的活化等相关；瘀血内结组与正常对照组差异蛋白主要与调节外界刺激、促进白细胞及单核细胞的增生等有关；气虚阳微型与正常对照组差异蛋白则与正调控 IL-12产生，白细胞及单核细胞的增生相关。 3.对筛选出的差异蛋白进行信号通路（ pathway）分析，食管癌患者组与正常对照组以 Cytokine-cytokine receptor interaction、 PI3K-Akt signaling pathway、 Jak-STAT signaling pathway和 Chemokine signaling pathway为主；P组与正常对照组以 Cytokine-cytokine receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway和 Pathways in cancer为主；F组与正常对照组以 Cytokine-cytokine receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway和 Chemokine signaling pathway为主；B组与正常对照组以 Cytokine-cytokine receptor interaction、Jak-STAT signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway和Toll-like receptor signaling pathway为主； Q组与正常对照组以Cytokine-cytokine receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、Rap1 signaling pathway和 Ras signaling pathway为主。 4.清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）均能抑制食管癌细胞 EC-1、EC9706、Eca109和 TE-1的增殖，并且其抑制作用的大小由强到弱依次为全方组、清热组、化痰组，细胞的形态也发生明显的变化。 5.清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）均能影响四种食管癌细胞的细胞周期，清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞EC9706、EC-1、Eca109和 TE-1细胞周期均有影响。与空白对照组相比， EC9706、Eca109和 TE-1细胞的清热组、化痰组和全方组 S期细胞均有所减少，且清热组变化最明显；EC-1细胞细胞化痰组 G2期细胞增加明显， G1期细胞减少明显。 6.清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）可以下调 EC-1、EC9706、Eca109和 TE-1细胞中 MMP1、MMP14、OPG、FBLN5和 PECAM-1的表达，且均为用药组的表达低于空白组。 结论： 1.蛋白芯片技术能够大范围、高通量地检测蛋白质的表达，可能作为筛选肿瘤分子标志物的新方法； 2.不同证型食管癌患者存在不同的差异表达蛋白，其主要功能也不同； 3.清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞 Eca109、EC9706、TE-1和 EC-1增殖的抑制作用存在剂量依赖和时间依赖关系； 4.清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）对食管癌细胞 Eca109、EC9706、TE-1和 EC-1的细胞周期有影响； 5.清热化痰方及其拆方（清热方和化痰方）抑制食管癌细胞 Eca109、EC9706、TE-1和 EC-1的增殖与调节 MMP1、MMP14、OPG、FBLN5和PECAM-1蛋白表达相关。食管癌痰、热、瘀、虚分子病机与不同分泌蛋白的表达相关。