大肠杆菌中YihE介导的喹诺酮超敏感性及调控途径研究

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通过一步PCR法敲除了大肠杆菌中yihE基因,发现yihE基因突变株对nalidixie acid和ciprofloxacin等quinolone类药物均具有高度的超敏感特性,即使在细胞蛋白质合成系统被抑制时也高度敏感。 为了研究YihE与在外境不利环境作出适应性反应的Cpx二组份系统之间的调控关系,通过P1转导构建了一系列相同背景的cpx与ythE基因的单双突变株并比较了这些突变株对药物的敏感性。结果表明Cpx蛋白和YihE蛋白作用于相同的nalidixic acid杀菌途径中,同时CpxR除了对yihE基因的表达起关键的调控作用外还能够调控其它的保护因子参与对细菌的保护。此外,不同quinolone药物对突变株的致死效应也说明了此类类药物的结构不影响Cpx和YihE蛋白的功能。 对YihE的上位效应分析表明,YihE既不参与对损伤DNA的修复,也与参与蛋白降解的Lon没有关系,却与ChpB和ChpAIK介导的细菌程序性死亡有关。 利用实时定量PCR实验分析了Cpx与yihE基因的调控关系以及各组份在调控链中的作用。结果表明在正常情况下,对数中期时yihE基因的表达不需要CpxA,在稳定期时CpxA对yihE基因的表达可能起到了一个负调控作用。而在药物处理情况下,CpxA没有参与对数中期时yihE基因的表达而参与了稳定期时yihE基因的表达。CpxR则在不同的条件下和不同的个生长期对于yihE基因的表达都是必需的。 β-半乳糖苷酶活性测定实验相对定量了yihE基因在翻译水平的表达情况,与实时定量PCR相比,YihE蛋白的表达不管在对数期还是在稳定期均相对稳定,不受药物处理的影响。而在cpxA突变株中,YihE蛋白的表达量上升说明了CpxA能负调控yihE基因的表达。 还检测了cpx与yihE单双突变对其它环境压力的敏感性,包括UV、SDS和低pH环境。结果显示cpx系统与yihE基因的缺失均能导致细菌对UV超敏感。
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