论文部分内容阅读
株高是农作物的重要农艺性状之一，适度矮化有利于农作物的耐肥、抗倒、高产等。20世纪50年代，以日本的赤小麦为矮源的半矮秆小麦的培育和推广，使得世界粮食产量显著增长，被誉为“绿色革命”。迄今为止，已报到的麦类矮秆、半矮秆基因已达70多个，但由于某些矮源极度矮化或者矮化的同时伴随不利的农艺性状，使得真正运用于育种实践的矮源较少。因此，发掘和鉴定新的控制麦类作物株高的基因，开展株高基因定位、克隆及作用机理等方面的研究，对实现麦类作物株高的定向改良，具有重要的理论意义和应用价值。
簇毛麦(Dasypyrum villosum，2n=14，VV)是禾本科簇毛麦属一年生二倍体异花授粉植物，为栽培小麦的近缘属。本课题组在不同来源的簇毛麦杂交后代中发现了一株自然突变产生的矮秆突变体。观察分析了该突变体的生物学特性，对矮秆性状进行了遗传分析，对茎节细胞长度、花粉的活力进行了细胞学观察，考察了该突变体内源赤霉素含量及不同浓度外施赤霉素对突变体的作用，分析了赤霉素生物合成途径中的内根贝壳杉烯氧化酶(KO)和赤霉素20氧化酶(GA20ox)的转录水平，对赤霉素20氧化酶和赤霉素3-p羟化酶(GA3ox)进行了克隆和序列分析，并对GA20ox进行了原核表达和表达的组织特异性研究。
主要研究结果如下：
1.该突变体与对照植株在苗期无差异，在拔节后期才表现出植株矮小，相对对照植株，节间伸长明显受到抑制，叶鞘长度基本不变。在成熟期，对照植株的平均株高为110cm，而突变株的平均株高为32cm，仅为对照植株的1/3左右。除了株高变矮以外，在成熟后期，突变株还表现一定程度的早衰和雄性不育。I2-KI染色法观察花粉活力结果表明，对照植株花粉90％以上都是有活力的，而突变植株的花粉仅20％左右有活力。
2.突变株与对照植株的杂交F1代均表现正常株高，表明该突变性状为隐性突变。F1代植株相互授粉得到的168株F2代植株中，株高出现分离，正常株高(株高高于80cm)与矮秆植株(株高矮于40cm)的株数比为130:38，经卡方检验，其分离比符合3:1的分离比，因此推测该突变体属于单基因的隐性突变。
3.用ELISA方法检测突变株和对照植株的幼嫩种子中内源性生物活性赤霉素(GA1+3)含量，结果表明突变株的赤霉素含量为36 ng/ml，而对照植株的赤霉素含量为900 ng/ml。对突变株外施赤霉素，发现矮秆突变株的株高和花粉育性均可得到恢复。这些结果表明该突变株为赤霉素缺陷型突变。
4.用荧光定量PCR方法比较突变株与对照植株中内根贝壳杉烯氧化酶和赤霉素20氧化酶的转录水平，结果表明突变株的KO转录水平比对照植株分别提高了6倍(苗期)和16倍(成熟期)，突变株的GA200x转录水平与对照植株在苗期无明显差异，在成熟期突变株较对照植株则提高了10倍左右。这些结果表明该矮秆突变体与赤霉素的生物合成途径密切相关，而且极有可能在赤霉素的生物合成途径早期就发生了改变。
5.以簇毛麦总基因组为模板，同源克隆了GenBank登录号为EU142950，RT-PCR分离克隆了簇毛麦的GA30x基因cDNA全长序列，分析结果表明该cDNA全长1206bp，含完整编码区1104bp，推测该序列编码蛋白含368个氨基酸残基，分子量为40.063KD，等电点为6.27。预测的氨基酸序列含有双加氧酶的活性结构，在酶活性中心2个Fe离子结合的氨基酸残基非常保守。该序列与小麦、大麦和水稻的GA30x基因一致性分别为98％、96％、86％。基因组序列与cDNA序列在外显子部分一致，在478-715bp和879-1019bp处分别含238bp和140bp的内含子。
6.通过RT-PCR技术克隆了簇毛麦的GA200x基因全长，命名为DvGA200x，GenBank登录号为EU142949。该基因全长1080个碱基，编码359个氨基酸，具有典型的植物GA200x基因结构。该基因编码的蛋白质与小麦、大麦、黑麦草等GA200x蛋白的同源性分别为98％，97％和91％。该序列重组到原核表达载体pET-32a(+)上，将获得的重组子pET-32a(+)-DvGA200x转化大肠杆菌BL21pLysS后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明，DvGA200x基因在大肠杆菌中获得了高效表达，融合蛋白分子量为55kDa。定量PCR分析表明，该基因在簇毛麦不同器官中的表达差异明显：叶片中表达水平最高，根部表达水平次之，茎部和穗中表达较弱。在外施赤霉素后，该基因的表达水平在两小时以后急剧下降，表明该基因的表达受自身的反馈调节。
本研究结果认为，(1)该簇毛麦矮秆突变体为单基因的隐性突变；(2)该矮秆突变体为赤霉素敏感突变，内源赤霉素含量检测表明突变体的内源性赤霉素含量仅为对照植株的1/30；(3)荧光定量PCR结果表明突变株的赤霉素生物合成途径的关键酶基因表达水平比对照植株高，而且突变植株的赤霉素生物合成改变很可能发生在赤霉素生物合成途径的早期；(4)GA200x有表达的组织特异性，且受到自身产物的反馈调节。