【摘 要】
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本研究旨在应用核糖体展示技术筛选出与人的CD28分子特异性结合的单链抗体,以期CD28单抗能更好的应用于肿瘤的免疫治疗。
首先,从Jurkat细胞中得到CD28分子的基因,经过
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本研究旨在应用核糖体展示技术筛选出与人的CD28分子特异性结合的单链抗体,以期CD28单抗能更好的应用于肿瘤的免疫治疗。
首先,从Jurkat细胞中得到CD28分子的基因,经过酶切连接入表达载体pET28并进行原核表达。
以原核表达纯化的重组CD28蛋白抗原免疫Balb/c小鼠,每隔两周免疫一次,共免疫4次。免疫后,取小鼠脾脏并分离总RNA,设计简并引物,逆转录合成cDNA,PCR扩增小鼠重链可变区VH和轻链可变区κ。通过重叠延伸PCR,经linker DNA连接形成抗CD28单链抗体库。
从构建的抗CD28单链抗体库中,应用核糖体展示技术筛选抗CD28的单链抗体。所构建的单链抗体库,经过体外转录翻译后,形成“单链抗体—核糖体-mRNA”三元复合物,并以此进行体外筛选。先以His蛋白负筛,再以CD28为抗原进行筛选。经过三轮筛选,RT-PCR扩增单链抗体片段,并连接到pET43.1a表达载体中。转化E.coli DH5a,挑取单克隆,用鉴定为阳性的重组子转化E.coli BL21(DE3),IPTG进行诱导表达。经过镍柱亲和纯化后,间接ELISA检测表达的单链抗体对CD28分子的亲和力。
我们以重组表达的人CD28蛋白为抗原进行核糖体展示筛选,经过三轮筛选后,获得了一株对人CD28有高特异性亲和力的单链抗体。为抗CD28单链抗体用于双特异性抗体的制备及其在T淋巴细胞增殖等方面的应用研究提供了基础。
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