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目的
胆道闭锁(biliary atresia, BA)是引起小儿肝脏纤维化的常见疾病，预后差，病死率高，发病机制仍未明了，缺乏有效的诊疗方式，亟需合适的动物模型进行研究，但现有动物模型存在诸多缺陷，主要表现为只能模拟BA急性炎症反应，而缺乏慢性纤维化的病理过程，这对BA肝纤维化诊断治疗方面的应用价值有限。前期在对髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的研究中发现使用MDSCs特异性抗体anti-Gr-1可建立慢性纤维化BA动物模型，与临床BA患者病理特征相似。抑制MDSCs为什么可以诱导BA小鼠发生慢性肝纤维化？预实验显示：该模型小鼠树突状细胞(dendritic cells，DC)及T细胞数量显著性下降，提示MDSCs分化成DC数量减少，从而降低了对新生小鼠初始T细胞的激活及增殖，因而减低了T细胞主导的急性胆管损伤。拟进一步优化实验条件以提高该动物模型的成功率及可控性，并初步明确其免疫机制，本课题将1)优化实验条件：包括注射抗体的时间、剂量和次数；2)监测病毒滴度的变化；3)论证该小鼠MDSCs、DC及T细胞三者的关系；4)使用临床标本对关键免疫细胞及分子进行验证。本动物模型的建立将为胆道闭锁发病机制研究及药物开发提供新平台。
材料/方法
1.构建慢性纤维化胆道闭锁动物模型：Balb/c小鼠出生24小时内腹腔注射MDSCs特异性抗体anti-Gr-1(2.5μg/g)；经anti-Gr-1反应4小时后，再次腹腔注射猴MMU18006轮状病毒20μL(滴度：1.5×106PFU)；并于小鼠生后第4d、8d、12d注射anti-Gr-1，持续观察至42d，建立慢性纤维化胆道闭锁动物模型。
2.观察小鼠的生存状况：包括生长体重、大小便颜色、皮肤颜色、毛发颜色、生存时间等。
3.标本的采集与保存：于第1、3、7、9、12、18、35、42d分别收取肝脏组织及肝外胆道组织标本，收获时1)拍照记录肝脏外观、胆囊外观、脾脏外观、肝外胆道外观、腹水颜色、十二指肠、结肠内容物颜色；2)常规胆囊注射美蓝进行肝外胆道造影，确认是否存在肝外胆道闭锁：小鼠麻醉后，切开腹部，在显微操作台上暴露好肝门部，从胆囊底部注射美蓝溶液，观察左右肝管和胆总管是否有美蓝存在，并在显微镜下拍照记录；3)心脏采血进行肝功能分析；4)收取部分肝脏及肝外胆道保存于10%福尔马林；5)部分新鲜肝脏组织用OCT进行包埋；6)脾脏及部分肝脏组织分别制成单个核淋巴细胞悬液；7)部分新鲜肝脏组织液氮保存。
4.肝组织纤维化及肝内胆管检测：应用H&E、苦味酸-天狼星红染色，观察肝脏炎症细胞浸润程度、肝纤维化程度；应用偏振光镜成像技术观察并比较小鼠、BA患者肝脏纤维化程度；应用免疫荧光染色观察小鼠肝内胆管(CK-19阳性)变化，以及采用不同荧光抗体CK19、Sox9、Gr-1等进行双染或三染，观察胆管与MDSCs之间的关系；应用免疫组织化学CD177染色，观察纤维化组织中CD177蛋白的表达水平、表达部位与MDSCs之间的关系。
5.轮状病毒滴度检测：应用荧光定量PCR分别检测并比较模型组、对照组及正常组第4、9、12d的肝脏组织中RRV的NSP3基因的表达水平，观察RRV的滴度变化与MDSCs之间的关系。
6.免疫细胞检测：收集肝脏纤维化前期的第3、9、12、18d的肝脏组织，分别使用免疫荧光和流式细胞学技术分析免疫细胞的分布和数量，检测的细胞为与胆道闭锁以及肝脏纤维化密切相关免疫细胞(如肝星状细胞、间充质干细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等)。
结果
1.MDSCs的流式细胞术检测结果：1)临床患者流式数据显示：BA组与疾病对照组、同龄正常对照组的血样PBMCs中MDSCs及其亚群(G-MDSCs和M-MDSCs)比较存在显著的统计学意义(P＜0.01)，其中G-MDSCs可能具有重要作用；2)小鼠肝脏流式数据显示：经anti-Gr-1注射24h后，实验组肝脏中的MDSCs百分比与正常对照组比较[(8.98±1.03)%比(15.75±1.10)%，t=11.12，P＜0.05]，具有统计学意义，去除率为42.9%，至48h后MDSCs百分比为(4.57±0.95)%，去除率达到70.9%。
2.利用anti-Gr-1抗体有效抑制肝脏MDSCs的方法：1)在急性炎症阶段：BA小鼠体重增加缓慢，生存时间延长；2)在慢性纤维化阶段：BA小鼠临床表现及病理学分析与临床BA患者相吻合，呈现BA慢性纤维化的过程。
3.小鼠MDSCs、DC与T细胞的流式细胞术检测结果：1)模型组新生小鼠经注射anti-Gr-1抗体后，能有效清除其体内的MDSCs，以G-MDSCs减少最为明显；2)与正常组比较，模型组小鼠体内DC数量于出生后第7天开始显著升高(P＜0.01)，但仍远低于病毒组DC数量(P＜0.01)；3)在炎症急性期，感染RRV小鼠体内的CD4+和CD8+T细胞表达水平增高；而抑制了MDSCs后的RRV小鼠，其CD4+和CD8+T细胞表达水平明显下降。
4.免疫组织化学检测结果：1)正常组小鼠肝脏MDSCs主要分布在门静脉周围，这与新生小胆管(CK19、Sox9阳性)的发育的部位一致，而肝脏其他部位亦可发现少量MDSCs；模型组小鼠肝脏在急性炎症阶段中(出生后第7、14天)，几乎没有在门静脉周围见到Ly6G/Ly6C阳性细胞，仅见大量的炎症细胞浸润；2)正常组小鼠肝脏CK19及Sox9阳性细胞主要分布在门静脉周围，胆管结构完整；而模型组小鼠肝脏CK19及Sox9阳性细胞呈片状分布，胆管上皮细胞缺如、结构排列紊乱，肝内胆管发生闭锁，同时伴有大量的炎症细胞浸润。
结论
1.在感染RRV的新生小鼠上，利用anti-Gr-1抗体有效抑制小鼠肝脏MDSCs的方法，能够建立一种BA慢性纤维化小鼠模型，该模型的临床表现及病理学分析与临床BA患者相吻合。
2.肝脏MDSCs数量下降将导致抗原提呈细胞的DC细胞数量减少，从而降低了T细胞的激活及增殖，因而T细胞主导的急性胆管损伤将大为减少。
3.在慢性纤维化阶段，小鼠肝脏MDSCs的数量明显减少，与临床BA患者相吻合。
4.小鼠肝脏MDSCs主要分布在门静脉周围，这可能与肝内胆管上皮细胞的发育有关。
胆道闭锁(biliary atresia, BA)是引起小儿肝脏纤维化的常见疾病，预后差，病死率高，发病机制仍未明了，缺乏有效的诊疗方式，亟需合适的动物模型进行研究，但现有动物模型存在诸多缺陷，主要表现为只能模拟BA急性炎症反应，而缺乏慢性纤维化的病理过程，这对BA肝纤维化诊断治疗方面的应用价值有限。前期在对髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的研究中发现使用MDSCs特异性抗体anti-Gr-1可建立慢性纤维化BA动物模型，与临床BA患者病理特征相似。抑制MDSCs为什么可以诱导BA小鼠发生慢性肝纤维化？预实验显示：该模型小鼠树突状细胞(dendritic cells，DC)及T细胞数量显著性下降，提示MDSCs分化成DC数量减少，从而降低了对新生小鼠初始T细胞的激活及增殖，因而减低了T细胞主导的急性胆管损伤。拟进一步优化实验条件以提高该动物模型的成功率及可控性，并初步明确其免疫机制，本课题将1)优化实验条件：包括注射抗体的时间、剂量和次数；2)监测病毒滴度的变化；3)论证该小鼠MDSCs、DC及T细胞三者的关系；4)使用临床标本对关键免疫细胞及分子进行验证。本动物模型的建立将为胆道闭锁发病机制研究及药物开发提供新平台。
材料/方法
1.构建慢性纤维化胆道闭锁动物模型：Balb/c小鼠出生24小时内腹腔注射MDSCs特异性抗体anti-Gr-1(2.5μg/g)；经anti-Gr-1反应4小时后，再次腹腔注射猴MMU18006轮状病毒20μL(滴度：1.5×106PFU)；并于小鼠生后第4d、8d、12d注射anti-Gr-1，持续观察至42d，建立慢性纤维化胆道闭锁动物模型。
2.观察小鼠的生存状况：包括生长体重、大小便颜色、皮肤颜色、毛发颜色、生存时间等。
3.标本的采集与保存：于第1、3、7、9、12、18、35、42d分别收取肝脏组织及肝外胆道组织标本，收获时1)拍照记录肝脏外观、胆囊外观、脾脏外观、肝外胆道外观、腹水颜色、十二指肠、结肠内容物颜色；2)常规胆囊注射美蓝进行肝外胆道造影，确认是否存在肝外胆道闭锁：小鼠麻醉后，切开腹部，在显微操作台上暴露好肝门部，从胆囊底部注射美蓝溶液，观察左右肝管和胆总管是否有美蓝存在，并在显微镜下拍照记录；3)心脏采血进行肝功能分析；4)收取部分肝脏及肝外胆道保存于10%福尔马林；5)部分新鲜肝脏组织用OCT进行包埋；6)脾脏及部分肝脏组织分别制成单个核淋巴细胞悬液；7)部分新鲜肝脏组织液氮保存。
4.肝组织纤维化及肝内胆管检测：应用H&E、苦味酸-天狼星红染色，观察肝脏炎症细胞浸润程度、肝纤维化程度；应用偏振光镜成像技术观察并比较小鼠、BA患者肝脏纤维化程度；应用免疫荧光染色观察小鼠肝内胆管(CK-19阳性)变化，以及采用不同荧光抗体CK19、Sox9、Gr-1等进行双染或三染，观察胆管与MDSCs之间的关系；应用免疫组织化学CD177染色，观察纤维化组织中CD177蛋白的表达水平、表达部位与MDSCs之间的关系。
5.轮状病毒滴度检测：应用荧光定量PCR分别检测并比较模型组、对照组及正常组第4、9、12d的肝脏组织中RRV的NSP3基因的表达水平，观察RRV的滴度变化与MDSCs之间的关系。
6.免疫细胞检测：收集肝脏纤维化前期的第3、9、12、18d的肝脏组织，分别使用免疫荧光和流式细胞学技术分析免疫细胞的分布和数量，检测的细胞为与胆道闭锁以及肝脏纤维化密切相关免疫细胞(如肝星状细胞、间充质干细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等)。
结果
1.MDSCs的流式细胞术检测结果：1)临床患者流式数据显示：BA组与疾病对照组、同龄正常对照组的血样PBMCs中MDSCs及其亚群(G-MDSCs和M-MDSCs)比较存在显著的统计学意义(P＜0.01)，其中G-MDSCs可能具有重要作用；2)小鼠肝脏流式数据显示：经anti-Gr-1注射24h后，实验组肝脏中的MDSCs百分比与正常对照组比较[(8.98±1.03)%比(15.75±1.10)%，t=11.12，P＜0.05]，具有统计学意义，去除率为42.9%，至48h后MDSCs百分比为(4.57±0.95)%，去除率达到70.9%。
2.利用anti-Gr-1抗体有效抑制肝脏MDSCs的方法：1)在急性炎症阶段：BA小鼠体重增加缓慢，生存时间延长；2)在慢性纤维化阶段：BA小鼠临床表现及病理学分析与临床BA患者相吻合，呈现BA慢性纤维化的过程。
3.小鼠MDSCs、DC与T细胞的流式细胞术检测结果：1)模型组新生小鼠经注射anti-Gr-1抗体后，能有效清除其体内的MDSCs，以G-MDSCs减少最为明显；2)与正常组比较，模型组小鼠体内DC数量于出生后第7天开始显著升高(P＜0.01)，但仍远低于病毒组DC数量(P＜0.01)；3)在炎症急性期，感染RRV小鼠体内的CD4+和CD8+T细胞表达水平增高；而抑制了MDSCs后的RRV小鼠，其CD4+和CD8+T细胞表达水平明显下降。
4.免疫组织化学检测结果：1)正常组小鼠肝脏MDSCs主要分布在门静脉周围，这与新生小胆管(CK19、Sox9阳性)的发育的部位一致，而肝脏其他部位亦可发现少量MDSCs；模型组小鼠肝脏在急性炎症阶段中(出生后第7、14天)，几乎没有在门静脉周围见到Ly6G/Ly6C阳性细胞，仅见大量的炎症细胞浸润；2)正常组小鼠肝脏CK19及Sox9阳性细胞主要分布在门静脉周围，胆管结构完整；而模型组小鼠肝脏CK19及Sox9阳性细胞呈片状分布，胆管上皮细胞缺如、结构排列紊乱，肝内胆管发生闭锁，同时伴有大量的炎症细胞浸润。
结论
1.在感染RRV的新生小鼠上，利用anti-Gr-1抗体有效抑制小鼠肝脏MDSCs的方法，能够建立一种BA慢性纤维化小鼠模型，该模型的临床表现及病理学分析与临床BA患者相吻合。
2.肝脏MDSCs数量下降将导致抗原提呈细胞的DC细胞数量减少，从而降低了T细胞的激活及增殖，因而T细胞主导的急性胆管损伤将大为减少。
3.在慢性纤维化阶段，小鼠肝脏MDSCs的数量明显减少，与临床BA患者相吻合。
4.小鼠肝脏MDSCs主要分布在门静脉周围，这可能与肝内胆管上皮细胞的发育有关。