论文部分内容阅读
目的：观察柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3，CVB3)对大鼠心肌成纤维细胞增殖和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)表达的影响，探讨OPN在病毒性心肌炎的可能作用机制。方法：取出生3～7天的SD大鼠心脏，改良法原代培养心肌成纤维细胞，利用细胞形态及细胞免疫化学染色对细胞进行鉴定；分别用不同滴度的CVB3感染心肌成纤维细胞，采用MTT法检测其OD值，用RT-PCR和Western-Blot检测OPN mRNA和蛋白的表达。结果：1．用胰酶与胶原酶合用消化分离心肌成纤维细胞，可提高心肌成纤维细胞的存活率，心肌成纤维细胞抗波形蛋白(vimentin)染色阳性，抗α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)染色阴性。2．用MOI分别为0、0.2PFU/cell、0.5PFU/cell、1.0PFU/cell的CVB3感染心肌成纤维细胞，MTT测得其OD值分别为0.35±0.05、0.37±0.04、0.66±0.07、0.32±0.07，MOI为0.5PFU/cell组OD值高于对照组、0.2PFU/cell组及1.0PFU/cell组，差异有显著性(P＜0.05)。3．用MOI为0.5PFU/cell的CVB3感染心肌成纤维细胞，用MTT测得对照组12h、病毒组12h、1d、2d、3d的OD值分别为0.36±0.06、0.47±0.06、0.56±0.04、0.72±0.04、0.64±0.02，病毒感染12h其OD值即增高，第2d达高峰，于第3d开始有下降趋势，各组比较差异均有显著性(P＜0.05)。4．用RT-PCR测得心肌成纤维细胞对照组12h、1d、2d、3dOPN/β-actin光密度比值分别为0.38±0.06、0.35±0.02、0.41±0.07、0.30±0.06，各组比较差异无显著性(P＞0.05)；病毒组12h、1d、2d、3d OPN/β-actin光密度比值分别为0.56±0.06、0.72±0.05、0.98±0.06、0.86±0.02，病毒感染12h其光密度值即增高，第2d达高峰，于第3d开始有下降趋势，各组比较差异均有显著性(P＜0.05)。5．用Western-Blot测得心肌成纤维细胞对照组12h、病毒组12h、1d、2d、3d OPN/β-actin灰度值分别为0.26±0.04、0.36±0.03、0.52±0.06、0.76±0.06、0.62±0.03，病毒感染12h其灰度值即增高，第2d达高峰，于第3d开始有下降趋势，各组比较差异均有显著性(P＜0.05)。6．将RT-PCR OPN/β-actin光密度值及Western-Blot OPN/β-actin与MTT(OD)值进行相关分析，Pearson相关系数分别为r=0.951，P=0.000及r=0.954，P=0.000，二者呈正相关关系。结论：1．一定滴度的CVB3可诱导心肌成纤维细胞增殖。2．CVB3可使心肌成纤维细胞增殖及OPN表达增加，在一定时间内呈时间依赖性。3．OPN表达与心肌成纤维细胞增殖呈正相关，提示OPN可能通过与心肌成纤维细胞增殖互为因果，共同参与病毒性心肌炎的发病机制。