超积累型东南景天铜/锌超氧化物歧化酶基因的功能分析

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超积累型东南景天(Sedum alfredii Hance)是我国衢州地区古老Pb/Zn矿区发现的一种新的镉超积累植物,从实验室前期完成的东南景天转录组数据中筛选出一个和耐镉相关的基因SaCu/Zn SOD,将该基因转入拟南芥中以研究其在植物镉胁迫耐受机制中的功能。转基因拟南芥Cu/Zn SOD超表达植株的获得已由本实验室前期工作完成,利用浓度为50 mg·L-1的卡那抗生素(Kan)对前期收获的转基因拟南芥Cu/Zn SOD超表达植株T3代种子进行纯合体筛选。利用RT-PCR技术,以野生型拟南芥作对照,检测SaCu/Zn SOD基因在纯合株系中的相对表达量。结果显示,该基因在纯合株系中均能正常表达,选取相对表达量最高的三个纯合株系(D10-2-2、D10-4-3、D10-7-3)用作研究材料。  以5 mM·L-1 CdCl2水溶液浇灌生长一致的野生型和转基因拟南芥,收获处理前、处理一周、两周和三周时的叶片,测定其中的超氧阴离子和过氧化氢含量变化。结果显示,超氧阴离子和过氧化氢在野生型拟南芥中积累,而在转基因拟南芥中维持在较稳定水平,说明转基因拟南芥跟野生型相比具有更强的清除活性氧的能力。  用50μM浓度的CdCl2处理10天左右的拟南芥幼苗,并在22℃,16h光照/8 h黑暗的环境中培养24h,利用非损伤微测技术检测其根尖分生区镉离子流速。结果显示,野生型和转基因拟南芥镉离子流都呈现较为稳定的内流趋势,其流速在4pmol·cm-2·s-1到93pmol·cm-2·s-1范围内变化。处理前后的平均流速分别为野生型为9.2pmol·cm-2·s-1、19.8pmol·cm-2·s-1,转基因型 D10-2-2为9.7pmol·cm-2·s-1、10.4pmol·cm-2·s-1,转基因型D10-4-3为13.8pmol·cm-2·s-1、14.6pmol·cm-2·s-1,转基因型D10-7-3为43.6pmol·cm-2·s-1、63.2pmol·cm-2·s-1。收获5mM.L-1 CdCl2水溶液浇灌两周的野生型和转基因型拟南芥地上部分,利用SolaarM6原子吸收光谱仪和火焰原子吸收光度法测定其地上部分镉离子含量。结果显示,处理后的野生型和转基因型拟南芥中镉离子含量明显高于处理前,非损伤微测结果中流速大的转基因型拟南芥中镉离子含量高于另外三个株系,说明镉离子在处理过程中在拟南芥地上部分积累,积累量最大的转基因型拟南芥可能具有更强的吸收镉和耐镉的能力。  对50μM浓度的CdCl2处理的Cu/Zn SOD转基因拟南芥进行基因芯片分析,通过基因表达差异分析筛选出一部分氧化还原相关基因,主要包括:过氧化物酶(POD)、谷氧还蛋白家族(Glutaredoxin family)、细胞色素P450(cytochrome P450)等,也包括过氧化氢酶(CAT)、过氧化物还原酶(PrxR)等与活性氧清除相关的基因。分析芯片中上述这些基因的表达模式,发现与野生型相比转基因拟南芥中氧化还原相关基因在胁迫时间一周时普遍上调,转基因拟南芥中活性氧清除相关基因的上调,使转基因拟南芥具有更强的活性氧清除能力,从而表现出更强的抗氧化胁迫能力,提高了转基因拟南芥的耐镉能力。
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