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研究背景:老年痴呆症，又称阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种由脑部慢性病变损害导致老年人记忆、思维和行为障碍的神经退行性疾病。随着人口的持续老龄化，AD已成为继心脏病、癌症、中风之后的“第四大杀手”。神经科学家们已经知晓AD的临床表现主要为痴呆，脑内典型的病理特征是老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)及学习记忆密切相关的脑区神经元进行性减少等。但AD的发生发展的确切分子机制尚未明了，亦缺乏有效的预防治疗药物，现在的治疗方法仍然以对症为主。由于这些治疗方法并没有从根本上消除AD的病因，因此不能阻止AD的病程进展，疾病仍然会进行性恶化。功能性神经元进行性丢失是AD病理的共同特征。程序性细胞死亡(即凋亡)在功能性神经元进行性丢失过程中发挥重要作用。神经元凋亡在一定时间内是可逆的，因此，阻止神经元凋亡的神经保护剂能够有效控制神经退行性疾病的病程。随着人们对AD认识的深入和对高素质生活要求的提高，对抗神经元凋亡药物的需求大幅度增加。抗凋亡的药物能维持神经元功能，可防止AD的疾病发展和恶化，有改善患者症状和提高生活质量的作用，所以研发新型神经保护剂有着巨大的科学、经济和社会意义。
相关神经科学家普遍认可AD是一种多病因、多基因、多环节性机制介导的疾患。AD是一个复杂多因素介导的大脑综合症，即由多个不同而又互相关联的生物学变化所引起的病理过程。目前“一药一靶位”的药物治疗效果非常有限。越来越多的实验证据表明，研发“一药多靶位”的药物将可能代表防治AD的最有前途的方向。另一方面，证据已表明谷氨酸受体，尤其是N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体的过度激活在神经退行性疾病中发挥重要作用。过去很长一段时间NMDA受体一直被视为神经保护剂开发的药物靶标，然而众多NMDA受体的阻断剂在临床实验中被淘汰，其临床应用受到极大限制。这主要是因为谷氨酸是细胞生命活动中的重要生物调节分子，NMDA受体作为神经系统一个重要的谷氨酸神经递质受体也介导神经元的生存、神经系统的发育、兴奋性突触传递和突触可塑性等重要生理功能。NMDA受体阻断剂干扰了这些正常生理功能必将引起一些严重的副作用，因此临床耐受性好的，安全有效的NMDA受体阻断剂是人们寻找的焦点。最近Lipton等人提出了一个开发临床耐受性好的，安全有效的神经保护剂的全新策略。这个策略的精髓在于这些药物选择性地作用于病理激活的靶标，而不干扰靶标介导的正常生理功能，这一类化合物被称为病理激活性治疗(PAT)药物。对于NMDA受体而言，病理性激活性药物可能是包括一类“反竞争性的，具有快速动力学特征的NMDA受体的通道阻断剂”(UFO)；美金刚(memantine)是这一类药物的代表，已用于中重度AD病人的治疗。另外，其它一些AD发病机制假说也都直接或间接与谷氨酸诱导的兴奋性毒性有关，这些假说包括淀粉样蛋白毒性学说，胆碱能学说、tau蛋白病理学说、自由基损伤学说等。因此，具有“一药多靶”和“病理激活”特征的NMDA受体阻断剂有望在AD的治疗中取得突破性的进展。
成功研制一系列包含他克林(tacrine)的高活性二聚体。一系列深入的药理及生化研究表明，上述某些二聚体化合物如双(7)-他克林与临床现有单体药物比较，展现出更强的药理活性和更低的不良反应。它们不仅对乙酰胆碱酯酶(AchE)的选择抑制作用更强，而且有良好的记忆增强和多元性神经细胞保护等效应。更重要的是，最新的研究表明双(7)-他克林可以对抗谷氨酸兴奋性毒性；它同美金刚(memantine)有着相似的强度在MK-801位点适度抑制NMDA受体，但是其抗谷氨酸兴奋毒性的效力大大高于美金刚。推测双(7)-他克林可能还作用一个或以上的胞内靶点对抗谷氨酸兴奋性毒性。另一方面，可喜地是，预实验结果表明双(3)-他克林可能是具有UFO特征的NMDA受体阻断剂。据此，本课题拟在已有的工作基础上，深入研究这两个二聚体的“一药多靶位”和/或“病理激活性作用”的分子机制。
结果:
第1部分双(7)-他克林：单分子多靶位抗谷氨酸毒性的分子机制
在研究双(7)-他克林的神经保护作用之前，建立谷氨酸兴奋毒性诱导的时间和剂量依赖性的小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡模型。谷氨酸诱导时间依赖性的神经元的死亡，开始于12小时，到48小时到达高峰；谷氨酸诱导剂量依赖性的CGNs死亡，开始于25μM，到300μM到达高峰。在CGNs，低浓度的谷氨酸更容易诱导细胞凋亡而不是坏死。Hoechst33324染色和TUNEL等检测表明：75μM谷氨酸诱导的神经元死亡具有凋亡特性包括细胞核集聚和TUNEL阳性染色明显增加等。接下来，观察双(7)-他克林对抗谷氨酸诱导的CGNs凋亡效应。用1μM双(7)-他克林预处理CGNs2小时，然后暴露于75μM谷氨酸，在指定的时间检测细胞存活率，或以逐渐增加浓度的双(7)-他克林预处理CGNs2小时，然后接触75μM谷氨酸24小时后以MTT方法检测细胞存活率。结果表明：双(7)-他克林呈现时间和剂量依赖性的抗谷氨酸诱导的神经毒性。另一方面，FDA染色检测表明：双(7)-他克林能阻止谷氨酸引起的神经元丢失和形态学改变包括广泛凋零的神经网络联系等；Hoechst33324染色和TUNEL等检测表明：双(7)-他克林可以显著阻止谷氨酸诱导的细胞凋亡特征。机制研究表明：①谷氨酸浓度依赖性地诱导释放NO和神经元死亡，以一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NMMA(NG-monomethyl-L-arginine)和一氧化氮(NO)清除剂能够阻止谷氨酸诱导的原代培养的神经元死亡。②双(7)-他克林比L-NMMA和美金刚有更高效抗谷氨酸诱导兴奋毒性和NO释放，比MK-801和美金刚有更高的效能减少谷氨酸引起的NO释放。③双(7)-他克林时间依赖性地阻止谷氨酸诱导的兴奋毒性和NO释放。④全细胞电流记录，配体受体结合法和共聚焦显微镜测胞内Ca2+技术等结果表明：与美金刚相似，双(7)-他克林在MK-801位点适度抑制NMDA受体。⑤上述结果表明：除NMDA受体外，NOS/NO可能是双(7)-他克林对抗谷氨酸兴奋性毒性的靶点。利用CGNs模型发现：双(7)-他克林与L-NMMA类似，略微抑制CGNs基础水平的NOS活性，然而，对谷氨酸激活NOS，双(7)-他克林的强度大大高于L-NMMA和美金刚。进行胞外NOS活性和抑制的测定结果表明：双(7)-他克林选择性抑制神经型、诱导型NOS的活性，而不抑制内皮型NOS的活性；并且双(7)-他克林对三型NOS比L-NMMA和7-nitroindazole有更高的选择性。并得到计算机分子对接模拟进一步支持。
第2部分双(3)-他克林：NMDA受体病理激活性神经保护作用的分子基础
他克林通过用不同长度的碳链连接而成的一系列二聚体具有长度依赖性地抑制AChE和GABA受体的效应。已经发现：双(7)-他克林可以在MK-801位点适度抑制NMDA受体。因此推测：他克林一系列二聚体可能有链长依赖性抑制NMDA受体的作用。在原代培养海马神经元，利用电生理技术研究他克林二聚体的链长和抑制NMDA受体的关系。发现系列双(n)-他克林二聚体均表现为浓度依赖性抑制NMDA激活电流。在-70到+50毫伏控制电位下，观察他克林二聚体(在1μM)对30μMNMDA激活电流的差异效应。结果表明双(3)-他克林而不是双(7)-他克林与美金刚相似：电压依赖性抑制NMDA激活电流，特点是控制电位越负，抑制作用越强。
NMDA受体拮抗剂具有反竞争性和快速解离(UFO)特性是有希望的治疗神经退行性疾病的候选药物：电压依赖性抑制NMDA激活电流可能是UFO特性的基础。双(3)-他克林NMDA受体起效和解离的时间(τon和τoff)动力学研究表明：双(3)-他克林有快速的起效和解离的动力学特点。预先加入双(3)-他克林没有影响NMDA受体激活电流；以NMDA和双(3)-他克林同时处理神经元，NMDA受体激活电流的振幅的逐渐下降到稳定水平，这表明双(3)-他克林有激动剂依赖性抑制机制。另外，双(3)-他克林可以使NMDA的激活电流的量效曲线下移，但不影响NMDA的激活电流EC50值，其抑制电流的百分率随NMDA浓度的增加而逐渐增加。这表明双(3)-他克林有反竞争性抑制NMDA受体的特点。分子对接模拟，放射性配体受体和单一残基突变技术表明：双(3)-他克林在NMDA受体的作用位点是MK-801位点。基于双(3)-他克林在抑制NMDA受体时所显现的反竞争性和快速解离的特点，推测双(3)-他克林应具有良好的神经细胞保护作用但不影响NMDA受体介导的生理功能。在CGNs谷氨酸毒性模型，双(3)-他克林呈现剂量依赖性的抗谷氨酸诱导的神经毒性，且随谷氨酸增加，双(3)-他克林神经保护作用增强。
结论:
1.双(7)-他克林保护神经元对抗谷氨酸诱导的细胞凋亡。
2.双(7)-他克林时间依赖性比美金刚和L-NMMA更有效地抑制谷氨酸诱导NO释放和兴奋毒性。
3.双(7)-克林在MK-801位点适度阻断NMDA受体，同时抑制细胞内外的一氧化氮合酶的活性。
4.双(7)-他克林逆转谷氨酸诱导的线粒体功能和蛋白成份的变化。
5.双(3)-他克林是NMDA受体MK-801位点上反竞争性和快速解离的阻断剂。
6.双(3)-他克林对抗谷氨酸兴奋毒性但不影响NMDA受体介导的LTP产生。