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蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)包括受体型酪氨酸激酶和非受体型酪氨酸激酶，在细胞的增殖、分化和迁移等相关信号转导过程中发挥着关键的调控作用。由基因突变或其他遗传特性的改变引起的蛋白酪氨酸激酶活性的异常调控和细胞恶性转化密切相关。因此，蛋白酪氨酸激酶成为肿瘤靶向治疗的重要靶标。迄今为止，已有数十种蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂和单克隆抗体进入临床，其中部分已经上市，为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的开发展示了光明的前景。本研究的主要目的是筛选新型蛋白酪氨酸抑制剂并深入探讨其抗肿瘤的机制，重点是靶向EGFR、HER2和Src酪氨酸激酶抑制剂的筛选及机制探讨。
本研究中，我们采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达了EGFR和HER2蛋白酪氨酸激酶的激酶区蛋白，并建立了基于ELISA的蛋白酪氨酸激酶的分子筛选模型。利用这一筛选模型及本实验室已建立的Src酪氨酸激酶筛选模型，我们对不同来源的近49000个化合物进行了筛选并得到了53个有激酶抑制活性的化合物。经过多轮结构修饰和活性测定，我们获得了一些新型结构的蛋白酪氨酸激酶抑制剂。其中，活性化合物MdOS和PH006分别是一个多靶点的激酶抑制剂和选择性的Src激酶抑制剂。我们对这两个化合物的抗肿瘤活性和抗肿瘤机理进行了深入系统的研究。
我们首次发现海洋来源的寡糖分子MdOS能够通过直接靶向酪氨酸激酶来抑制激酶活性。MdOS显示出广谱的酪氨酸激酶抑制活性，它能够显著抑制HER-2和EGFR受体酪氨酸激酶活性，IC50值分别为0.13±0.09和0.28±0.01μg/mL。MdOS对VEGFR2、VEGFR1、PDGFRβ和c-Src酪氨酸激酶也有很强的抑制活性，IC50值分别为1.8±0.6，2.4±0.4，1.8±0.3，0.7±0.2μg/mL，但对FGFR2没有明显的抑制作用。MdOS能够高亲和力地与蛋白激酶结合。进一步的分子模拟研究表明，MdOS主要是和蛋白激酶区ATP口袋入口处的氨基酸残基结合。与此相对应的是，随着ATP浓度的升高，MdOS对激酶的抑制活性降低。以上结果表明MdOS是一个ATP竞争性的抑制剂，通过和ATP竞争结合酪氨酸激酶的ATP口袋来抑制了酪氨酸激酶的活性。MdOS能进入细胞直接靶向激酶并有效抑制胞内酪氨酸激酶以及下游信号分子Erk和AKT的磷酸化。另外，MdOS从多个环节抑制新生血管生成，包括抑制生长因子刺激的人内皮细胞的增殖，抑制内皮细胞的管腔形成，大鼠动脉环的血管萌芽和鸡胚尿囊膜模型中的血管生成。总之，本研究为寡糖类分子的抗血管新生作用提出新的作用机制，同时为酪氨酸激酶抑制剂提供了新的结构骨架。此外，它和小分子抑制剂同激酶间结合模式的不同提示其可能在小分子抑制剂耐药方面有所突破。对这一类寡糖分子的构效关系的深入研究必将推动寡糖来源的多靶点激酶抑制剂的开发。
全新结构的嘌呤类化合物PH006是一个选择性的Src激酶抑制剂。PH006对Src酪氨酸激酶的IC50值为0.38μM；对c-Abl和c-kit也有一定的抑制活性，IC50分别为1.9和5.5μM；对其他受试的10种酪氨酸激酶活性的抑制作用较弱，在浓度为10μM时抑制率小于50％。PH006能直接和Src蛋白激酶区结合，KD=3.95×10-5M。进一步研究显示随着ATP浓度的升高，PH006对Src激酶的抑制活性降低，提示PH006可能和ATP竞争结合Src激酶的ATP结合位点，抑制Src激酶的活性。PH006能有效抑制MDA-MB-231细胞中Src及下游信号分子FAK、Paxillin的磷酸化，并抑制该细胞增殖和克隆形成，IC50分别为12.2和2.3μM。PH006诱导MDA-MB-231细胞阻滞于G1期，提示PH006对MDA-MB-231细胞增殖的抑制是通过诱导细胞周期阻滞。另外，PH006能够显著抑制MDA-MB-231细胞的运动能力，包括抑制细胞的黏附、迁移和侵袭。进一步研究表明，PH006对细胞运动能力的抑制作用与其抑制MMP2/9和HGF的分泌相关。PH006也能抑制MDA-MB-435细胞中Src介导的信号转导包括FAK的磷酸化，并抑制该强胞的黏附、迁移和侵袭。值得注意的是，PH006显示出良好的抑制MDA-MB-435乳腺癌裸小鼠移植瘤的生长和转移活性。在150mg/kg剂量下静脉注射给予PH006，处理组的原位瘤的平均瘤重为对照组的.59.6(P<0.05)。另外，PH006(150 mg/kg)显著减少MDA-MB-435乳腺痛的肺转移结数，抑制率为59.5％。总之，PH006是一个新结构的选择性Src激酶抑制剂，并表现出良好的体内外抗肿瘤生长和转移作用。
综上所述，本研究成功建立了稳定、灵敏的EGFR和HER-2激酶抑制剂的分子筛选模型，为开发新型激酶抑制剂奠定了基础。对广谱型酪氨酸激酶抑制剂MdOS作用活性和机制的研究，揭示了该化合物具有抗新生血管生成作用的特性。对选择性Src激酶抑制剂PH006的药理作用研究，揭示该化合物具有良好的体内外抗肿瘤和抗转移作用。以上研究结果为同类化合物的深入研究提供了详实的实验证据，同时为酪氨酸激酶抑制剂的发现和开发提供了崭新的思路。