论文部分内容阅读
随着人类基因组计划的完成和人们对疾病致病机理的深入研究，基因治疗有望成为今后疾病治疗的有效途经之一。然而基因治疗要取得突破性进展，必须解决一个关键性问题，即如何有效地将治疗基因输送到特定的靶细胞，并在该细胞中高效表达。受病毒微观结构及其在侵染细胞过程中各组分协调作用机制的启发，本文利用硫酸鱼精蛋白(PS)和胞内适当条件下可自去PEG化的PEG-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)偶联化合物，构建了一类新型高效的非病毒基因输送系统。
本文的研究内容包括：pH敏感型材料MeO-PEG-vinyl ether-DOPE(PVD)和胞内可降解材料MeO-PEG-S-S-DOPE(PSD)的合成与表征；PS/DNA复合物的制备及体外稳定性研究；pH敏感型多功能脂质纳米粒(PMN)、酶降解型多功能脂质纳米粒(EMN)以及叶酸修饰的酶降解型多功能脂质纳米粒(FMN)的制备和体外特性研究；脂质纳米粒输送基因的机制探讨；PMN和EMN的体内组织分布和体内转染效率研究及叶酸修饰的多功能脂质纳米粒FMN在肿瘤基因治疗中的初步应用研究。
在材料合成部分，我们分别利用酸不稳定的乙烯醚键和胞内可降解的二硫键，将PEG直接偶联到DOPE的亲水端。预期功能性材料PVD和PSD在适当的环境中，自动脱去PEG链，恢复DOPE的构象和特性。在参考文献的基础上，对已有材料PVD和PSD的合成路线进行了调整和优化。实验结果表明，本文所采用的合成路线，显著提高了目标化合物的收率。
多功能脂质纳米粒的构建主要包括两个步骤：1)以PS对DNA进行压缩和保护；2)形成的PS/DNA复合物再进一步包裹于DOPE与功能性材料PVD或PSD制备而成的脂质纳米粒中。实验结果表明，当PS与DNA的比例(W/W)大于或等于4时，制备所得PS/DNA复合物结构紧凑，粒径在60 nm左右，ζ电势约为20 mv，且PS能够保护复合物中的DNA免受超声破坏及DNase I的降解破坏。利用薄膜水化法制备的脂质纳米粒PMN和EMN(MeO-PEG，MW=2000)，均为粒径在180 nm左右的圆球形颗粒，纳米粒能够保护DNA免受DNase I的破坏，且电泳结果显示，纳米粒释放的DNA仍保持良好的稳定性和完整性，表明纳米粒的制备过程对PS/DNA复合物与DNA的稳定性无不良影响。体外释放结果表明，PMN和EMN在正常生理条件下，均能够保持完整的结构；而PMN在酸性条件下、EMN在谷胱甘肽存在的条件下，12小时内容物的累积释放量明显增加。体外释放试验的结果在一定程度上验证了本文的初步设想，即功能性材料PVD和PSD均能在适宜的降解条件下发生水解，进而促进内容物的释放。
以Luciferase基因为报告基因的体外转染效率评价实验结果表明，多功能脂质纳米粒PMN和EMN在HEK293、Hela和COS-7等细胞株中的转染效率，均明显优于裸DNA和PS/DNA复合物；与阳性对照LipofectamineTM2000相比，PMN和EMN亦有显著的优势。细胞摄取实验显示，与PS/DNA复合物相比，多功能脂质纳米粒PMN和EMN可能通过显著增加细胞对DNA的摄取量而增强转染效率。细胞内定位实验结果表明，与阳性对照LipofectamineTM2000相比，多功能脂质纳米粒PMN和EMN则可能通过增加DNA在细胞核的分布而增强体外转染效率。细胞核内荧光定量实验结果又进一步证实，与多功能脂质纳米粒PMN相比，EMN通过增加DNA向细胞核的转运量而提高转染效率。
多功能脂质纳米粒PMN和EMN的体内特性研究实验结果表明，在正常剂量下，多功能脂质纳米粒无明显毒性；PMN和EMN在荷瘤裸鼠体内，主要集中分布于肝脏，在肿瘤组织中办有一定的分布；与阳性对照LipofectamineTM2000相比，多功能脂质纳米粒在荷瘤小鼠瘤组织中的转染效率略有提高。
在构建多功能脂质纳米粒EMN的基础上，本文进一步采用在脂质层中插入少量叶酸修饰脂质(FA-PEG-DSPE)的策略，对脂质纳米粒EMN进行优化，构建了叶酸修饰的具有肿瘤主动靶向性多功能脂质纳米粒FMN，并对其理化特性和体外转染效率进行了评价。体外实验结果表明，少量异种脂质(FA-PEG-DSPE)的插入，对多功能脂质纳米粒的理化特性不产生明显影响。Hela细胞转染实验表明，与多功能脂质纳米粒EMN相比，叶酸修饰的脂质纳米粒FMN具有明显优势。细胞摄取实验显示，FMN的转染优势一定程度上来自于纳米粒的细胞摄取增加，而后者在一定程度上又与纳米粒FMN表面修饰的叶酸配体有关。
最后，本文以Survivin为靶基因，采用在体外构建能够表达shRNA的质粒(iSur-pDNA)，利用叶酸修饰的多功能纳米粒FMN将其转染进入细胞内，分别在细胞水平和动物水平初步探索了RNA干扰技术在肿瘤(如肝癌)基因治疗中的有效性，并以此来进一步验证本文所构建的多功能脂质纳米粒FMN作为新型高效基因载体的潜在应用价值。实验结果表明，在一定浓度范围内，载有iSur-pDNA的FMN在体外能够有效杀伤肝癌细胞BEL-7402，且与抗肿瘤药物多西他赛具有协同杀伤作用。而体内药效实验结果表明，载有iSur-pDNA的FMN和多西他赛对裸鼠体内肿瘤的抑制作用与两者单独使用时抑瘤效果相加无显著差异。该结果可能来自于载iSur-pDNA的FMN与多西他赛体内药物动力学及组织分布的差别。