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水是生命之源。在生物中水孔蛋白(aquaporin)介导了水分的跨膜运输,调节生物体内水分平衡。实验证明水孔蛋白广泛存在于从微生物到高等动物和植物中,并且在转录、翻译和翻译后修饰等各个水平上受到调控。在高等植物拟南芥、玉米和水稻中都有30多个水孔蛋白,如此数量庞大的水孔蛋白家族,暗示他们在保持植物水分平衡方面发挥重要的作用。
本研究建立了非洲爪蟾卵母细胞系统,并利用该系统测定了一些水孔蛋白的通水和通甘油的活性;研究了它们的功能及其对逆境胁迫的响应,主要的实验包括以下几个部分:
(1)非洲爪蟾卵母细胞系统的建立。非洲爪蟾卵母细胞系统是测定水孔蛋白活性的经典的实验方法。为了利用该方法鉴定水孔蛋白的功能,建立了非洲爪蟾卵母细胞体外表达系统,并利用这个系统测定了多个水孔蛋白的通水和通甘油活性。到目前为止,利用这个系统一共测定了9个水孔蛋白的通水活性和7个水孔蛋白的通透甘油活性。
(2)水稻TIP亚族水孔蛋白表达和功能的研究。在大而成熟的植物细胞中,液泡可以占到细胞体积的90%,并且具有很多重要的功能,包括利用液泡很容易产生大细胞,维持细胞的膨压,pH和离子稳态,以及物质的储藏和消化等。这些功能都与细胞水分平衡密切相关,而水分跨越液泡膜的运输是由液泡膜内在蛋白(TIP)构成的一类多功能的水孔蛋白介导和调控的。水稻基因组编码33个水孔蛋白,其中包括10个定位在液泡膜上的TIP(the tonoplast intrinsic protein),根据其同源性的差异进一步分为TIP1-5共5类。本研究得到了TIP1-5类中的6个TIP基因,利用非洲爪蟾卵母细胞系统研究了其通水和甘油的活性。发现OsTIP1;1,OsTIP1;2,OsTIP2;2,OsTIP4;1和OsTIP5;1有较高的通水活性,而OsTIP1;1和OsTIP3;2有较高的通甘油活性。用Real-time PCR技术发现水稻水孔蛋白OsTIP的表达有时空特异性,OsTIP3s在种子中积累,随着种子萌发迅速下降。OsTIP5;1在花器官和种皮中特异表达。与PIPs相反,大部分OsTIP基因在不同非生物胁迫(20%PEG6000、150 mM NaCl和100 μM ABA)下被明显上调,推测TIPs和PIPs之间可能存在协同作用,共同调节植物的水分平衡。
(3)OsPIP2;7的功能研究。低温高光强会引起植物水分吸收和蒸腾的不平衡,从而导致植物缺水。有报道证明植物水孔蛋白和冷胁迫有一定关系,水稻水孔蛋白PIPs对冷胁迫的响应结果表明,在冷处理条件下大多数的PIPs不论是在根中还是叶中都明显地被抑制表达。OsPIP2;3(根中特异表达)和OsPIP2;7在根中增加表达,而在叶片中降低表达。这些结果暗示在根中OsPIP2;3和OsPIP2;7增加表达可能有利于水分的吸收:OsPIP2;7在叶片中降低表达可能有利于减少水分的散失。因此,本研究克隆到了OsPIP2;7并证明它有较高的通水活性。原位杂交结果显示OsPIP2;7的表达有组织特异性。在酵母中表达也验证了OsPIP2;7可以明显地提高酵母对低温的抗性,进一步的转基因水稻实验证明,OsPIP2;7在一定程度上提高了水稻对低温的抗性。