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防御素是进化中的古老分子，在先天性免疫系统的宿主防御机制中起重要作用，在细菌、霉菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中，可以激活机体的第一道防御屏障，启动先天性免疫反应和获得性免疫反应。研究发现一些β-防御基因(例如DEFB1)在奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达，表明在乳房炎发生时β-防御素可能在乳腺局部防御中发挥作用，也有研究发现乳房炎能增加乳腺中BNBD-5的表达量约13倍，本实验室已经构建了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库，并将β-防御素基因初步确定为抗乳房炎的候选基因。因此，牛防御素可以作为抗乳房炎的候选基因进行进一步深入研究。牛防御素BNBD5从牛的嗜中性粒细胞中分离出来，其前体肽编码64个氨基酸，分子量为7228Da，具有抑制E.coli ML35活性，属分泌型蛋白。本实验以患乳房炎的荷斯坦奶牛为实验材料，提取血液白细胞总RNA，根据GenBank中注册的牛防御素BNBD5的cDNA序列设计引物，采用RT-PCR技术扩增出BNBD5基因的cDNA序列，将其克隆到pMD19-T载体中进行序列测定，将测序鉴定正确的克隆质粒命名为BNBD5/pMD19-T。设计5’端带有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物，利用PCR技术分别从含有BNBD5基因的BNBD5/pMD19-T重组质粒中扩增BNBD5基因编码区，大小为195bp，然后插入到pPICZαA载体的EcoRⅠ和XbaⅠ位点，这个载体具有a-factor分泌信号肽可将重组蛋白分泌到培养基上清中，而且具有Zeocin抗性标记利于抗生素筛选。用SacⅠ将重组表达质粒pPICZαA/BNBD5线性化后采用电转化和化学转化法转入毕赤酵母宿主菌GS115，插入到毕赤酵母染色体的高效启动子AOX1的下游。用高浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子。以重组毕赤酵母的菌液为模板，进行PCR鉴定。将阳性重组酵母转化子每24h添加1％甲醇进行诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明产物分子量约为7.8kD左右，基本与BNBD5蛋白相符。以上结果表明，本研究成功扩增出牛防御素BNBD5基因的编码区，并成功构建了牛防御素BNBD5的毕赤酵母表达载体pPICZαA/BNBD5，首次采用毕赤酵母表达系统进行了牛防御素BNBD5的表达。本论文的研究为进一步研究BNBD5蛋白的抑菌活性，纯化蛋白、制备抗体等下游工作奠定了基础。