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尼可霉素是由圈卷产色链霉菌和唐德链霉菌产生的一类核苷肽类抗生素,对植物病原真菌和人体病原真菌具有较强的抑制作用,在农业和医药上都具有很好的应用前景。尼可霉素生物合成的调控是一个复杂的过程,开展相关调控基因的研究具有重要的科学意义和潜在的应用前景。
本论文主要开展了以下两部分研究工作:
1.adpA-L在圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成和形态分化中的作用。
adpA-L所编码的蛋白与灰色链霉菌转录激活因子AdpA有较高的同源性。基因阻断和遗传互补实验表明:adpA-L是尼可霉素生物合成和形态分化所必需的。AdpA-L能够特异地结合在尼可霉素生物合成途径特异性调控基因-sanG基因启动子上游至翻译起始密码子约1kb的区域内。DNase1 Footprinting实验证实了这个区段包括五个不同的结合位点(site I、site II、site III、site IV和site V),并确定了其中的保守序列。AdpA-L对五个结合位点的亲和力次序依次:site I>site V>site IV>site II>site III。进一步的突变研究结果表明:site I具有开启sanG转录的作用,site V能进一步增强sanG的转录,而site II、site III和site IV则具有阻遏sanG转录的作用,其中site III位点的阻遏作用最强,另外,site II、site III、site IV和site V之间还存在着相互作用。体内实验结果表明:site III位点突变使尼可霉素的产量提高了1.5倍。综上所述,AdpA-L是通过控制sanG的转录来行使对尼可霉素生物合成的调控。最后本文推测了adpA-L调控sanG转录的可能模型。
2.圈卷产色链霉菌多效调控基因sabR的功能研究。
sabR编码的产物与链霉菌中已知的γ-丁酸内酯受体蛋白具有较高的同源性。实验室前期工作表明:sabR正调控尼可霉素的生物合成,同时又条件性地负调控圈卷产色链霉菌孢子的形成,是一个多效调控基因。本文工作表明,sabR除了负调控自身的转录外还能正调控sanG的转录,并且SabR能特异性地结合在sanG基因上游-64至-30之间的位置(该区域被命名为ARE1),同时发现ARE1在尼可霉素生物合成中扮演j下调控的角色。由于SabR不能结合自身启动子,也不能结合sanN-I、sanO-V和sanF-X这三个转录单元启动子的相关区域,因此sabR可能间接负调控自身的转录,而与sanN-I、sanO-V和sanF-X这些基因的转录没有直接关系。
上述有关多效调控基因及其作用方式的研究揭示了尼可霉素生物合成中所存在的新的分子调控机制,为尼可霉素生物合成机制的阐明和高产工程菌株的构建奠定了良好的基础。