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伊维菌素(Ivermectin,IVM)是当前防治畜禽寄生虫病的最佳药物之一。但在宠物临床使用时,对少数犬种特别敏感,如柯利牧羊犬、澳洲牧羊犬、喜乐蒂牧羊犬等,正常用量即可出现中枢神经中毒症状。Mdr1(多药耐药基因)编码的p-糖蛋白(药物转运蛋白)在血脑屏障中起着非常重要的作用,本文通过对敏感牧羊犬mdr1 mRNA基因表达水平的检测,对伊维菌素致敏感牧羊犬的分子中毒机制进行了研究。
本研究首先鉴定所选犬的基因型,然后通过实时荧光定量RT-PCR的方法研究了牧羊犬和普通犬各组织中mdr1 mRNA基因表达水平的差异性。根据基因库里的伊维菌素敏感牧羊犬mdr1cDNA基因和β-actin基因序列,设计合成两对引物。利用普通PCR方法,对血液中提取的DNA进行扩增并克隆,通过测序来鉴定基因型。利用SYBR Green I荧光染料,建立了检测犬各组织(大脑、小脑、肾脏、肝脏、小肠和脾脏)中mdr1 mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法。将mdr1基因片段和β-actin基因片段克隆至pMD19-T。载体上,以阳性质粒作为标准品,构建标准曲线,随后进行溶解曲线分析和稳定性研究。结果表明,mdr1基因片段和β-actin基因片段的Ct值线性范围分别为7.0～24.0、8.0～32.0;相关系数分别为1.005、0.975;溶解曲线显示产物都为单个特异性峰,Tm值分别为69.5±0.2℃、86.0±0.2℃;组内重复变异系数(C.V.％)在5%以下。建立的检测犬各组织mdr1 mRNA的Real-timeRT-PCR方法具有扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点,为在mRNA水平对犬各组织mdr1的定量分析奠定了基础。
选用8只犬,包括苏格兰牧犬、喜乐蒂牧羊犬、德国牧羊犬、罗威犬、金毛犬、拉布拉多犬、史宾格犬、普通犬各一只。经前肢静脉采血,装入EDTA抗凝管中,-20℃保存,以备普通PCR进行基因型鉴定。然后分别对苏格兰牧羊犬和普通犬按照0.2mg/kg体重皮下注射伊维菌素注射液,当苏格兰牧羊犬出现严重中毒症状时进行剖杀,迅速取出大脑、小脑、肾脏、肝脏、小肠和脾脏,液氮速冻,-80℃保存。按照已经建立的实时荧光定量方法对组织进行检测(加液氮进行组织研碎,抽提总的RNA,反转录合成cDNA,荧光定量PCR检测)。动物试验结果显示,皮下注射伊维菌素24h后,牧羊犬开始出现明显的中毒症状反应,而普通犬则无异常表现。中毒症状具体表现为:厌食、流涎、颤动、全身无力、精神抑郁、不能站立近乎昏迷等症状。基因型鉴定结果显示:苏格兰牧羊犬和喜乐蒂牧羊犬与上述其它犬相比,mdr1基因开放阅读框核苷酸230处的回文序列GATAG(ATAG或GATA)有4个外显子发生缺失。荧光定量结果显示:在所检测普通犬各组织中,mdr1基因mRNA在小肠表达量最高,其次为大脑、肾脏、肝脏、脾脏和小脑;而在苏格兰牧羊犬组织中mdr1 mRNA的表达量均很低,在肝脏表达量最高,其次为大脑、小肠、脾脏、肾脏和小脑。采用Spass软件分析结果显示:牧羊犬和普通犬相比,mdr1基因mRNA在各组织表达规律并不一致,而且存在显著性差异。由此可推断,苏格兰牧羊犬mdr1基因突变所致P-糖蛋白不能正常表达而丧失其功能活性,可能是其对伊维菌素异常敏感的重要原因,本研究结果为临床治疗合理谨慎用药提供一定的理论指导,也为伊维菌素致牧羊犬中毒的分子机理的进一步研究提供了一定的基础数据。牧羊犬组织内P-糖蛋白的表达量与其对伊维菌素敏感性的具体线性关系如何,尚有待进一步研究。