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本论文主要分为两部分:第一部分是关于四重霉素生物合成机制的研究;第二部分是关于FR901464生物合成机制的研究。
四重霉素(Quartromicins)是在东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis No.4427-8中分离到的一系列天然产物,属于螺环乙酰乙酸内酯家族。但与这家族其余分子相比较,结构上具有明显的差异,其分子骨架是对称的32元的全碳环结构,结构中具有两两对称的四个[6,5]螺环,糖苷配基连在两个相对的螺环上。本课题组之前已经成功地获得了其生物合成基因簇。
我们对四重霉素PKS链的生物合成机制进行了深入地研究。首先,表达并纯化了两个PKS蛋白QmnA2和QmnA3,同时化学合成了测活底物。接下来对QmnA2和QmnA3的活性进行了体外测试,结果显示QmnA3可以识别长度不同的两条PKS链,分别催化一次链延伸,从而阐明了四重霉素PKS链的生物合成机制,证实了在四重霉素PKS链延伸过程中存在链跳跃的机制。
与其它螺环乙酰乙酸内酯家族天然产物一样,四重霉素生物合成基因簇中也包含可能与乙酰乙酸内酯结构生物合成相关的5个基因,其中qmnD1编码甘油酰转移酶QmnD1,qmnD2编码酰基载体蛋白QmnD2,qmnD5编码3-氧乙酰基载体蛋白合成酶QmnD5。通过体外生化实验,证实了QranD1可以催化1,3-二磷酸甘油酸转到QmnD2上,QmnD5与Rk-682生物合成过程中RkD功能一样,可以催化β-酮酰-S-ACP与甘油酰-S-ACP反应,生成乙酰乙酸内酯结构。
FR901464是从假单胞菌Pseudomonas sp.No.2663中分离到的一种天然产物,具有非常好的抗肿瘤活性,最近发现其还可以抑制前体mRNA的剪切。对FRg01464的生物合成基因簇分析显示其是由trans-AT-PKS-NRPS杂合酶体系催化合成的,具有一个特殊的PKS起始模块,其中包含DH-KR-GT-ACP四个功能域。对DH、DH-KR、GT和ACP功能域分别进行蛋白表达并纯化,都获得了可溶性的蛋白。体外生化实验结果显示GT可以将1,3-二磷酸甘油酸转到ACP上,证实了FR901464是以1,3-二磷酸甘油酸作为起始单元进行生物合成的。DH可以催化甘油酰-S-ACP的β-位脱水,之后重排生成丙酮酰-S-ACP。
接下来,我们对FR901464生物合成过程中3个AT(Fr9B,FrgJ和Fr90)和所有的ACP进行了蛋白的表达与纯化。获得了可溶性的蛋白之后,对AT的活性进行了测试,初步结果显示Fr9B没有转移丙二酰辅酶A的功能;Fr9J和Fr90都可以以相同的速率催化丙二酰辅酶A转移到链延伸单元的ACP上;与Fr9J相比,Fr90将丙二酰辅酶A转移到β-支链途径的ACP上的活性更高,初步证实Fr90可能负责β-支链途径中MCoA的转移。
FR901464第一个延伸模块也很特殊,共包含有9个功能域,其中有两个未知功能的KS功能域和一个TE功能域。我们对其进行了蛋白表达和纯化,都获得了可溶性的蛋白,同时还合成了相关的测活底物,尝试通过体外生化实验来研究KS和TE的功能。