论文部分内容阅读
白色念珠菌是一种条件致病菌,当机体的免疫力下降或者正常菌群平衡被破坏时,会侵入深层组织引起系统性白色念珠菌感染。随着肿瘤放疗、化疗和大量广谱抗生素的使用,系统性白色念珠菌感染的发病率不断升高。由于白色念珠菌感染缺少明显的临床症状,所以导致早期诊断困难。临床上多采用血培养法,这种方法需要经过反复培养,耗时长、检出率低(仅为44％左右),并且通常在感染的晚期才能得到阳性结果,患者往往错过最佳的治疗时机。因此,寻找系统性白色念珠菌感染的早期检测方法对于该类疾病的诊断和治疗是非常重要的。
白色念珠菌感染过程中,体液免疫应答和细胞免疫应答都发挥了重要的作用。分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)和热休克蛋白90(Hsp90)是白色念珠菌的两个毒性分子。这两种抗体在白色念珠菌感染中都有保护作用。Sap2是一种蛋白水解酶,在感染的早期就发挥作用,参与降解宿主组织、逃避免疫保护等多个过程。Sap2能够诱导机体产生免疫应答反应,是一种免疫优势抗原。Hsp90是白色念珠菌另一个重要的毒性分子,也参与多种生理过程。白色念珠菌康复患者血清中含有Hsp90抗体,而恶化和死亡患者则没有或者含有很少该抗体。CD4+Th细胞的分化方向也是影响宿主对白色念珠菌抗性或易感的重要方面。Th1型细胞免疫应答能够抑制感染,分泌的细胞因子具有保护作用,而Th2型免疫应答则使宿主对白色念珠菌易感。这对于研究白色念珠菌感染的诊断试剂和疫苗具有指导意义。
本实验室前期工作证明,展示抗原表位的杂合噬菌体,在没有佐剂的情况下,就能够诱导实验动物产生特异性抗体。杂合噬菌体还能诱导小鼠的DTH反应、延长感染小鼠的存活时间、降低感染小鼠的死亡率。本论文将白色念珠菌Sap2的VKYTS表位展示在噬菌体表面,并对其诱导产生的体液免疫应答和细胞免疫应答进行了研究。同时利用四种抗原,Sap2重组蛋白、展示Sap2 VKYTS表位的杂合噬菌体、Hsp90重组蛋白、展示Hsp90 C表位的杂合噬菌体构建了间接ELISA方法,对系统性白色念珠菌感染兔血清和癌症患者血清进行了检测。得到结果如下:
(1)Sap2的VKYTS表位成功展示在噬菌体表面,杂合噬菌体在不需要佐剂的条件下就能够诱导小鼠产生抗展示表位的特异性抗体,还能识别癌症患者血清中的特异性抗体。
(2)体内RT—PCR和体外夹心ELISA实验结果证明,杂合噬菌体、与匙孔蓝蛋白(KLH)偶联的LKVIRKNIVKKMIE表位和重组蛋白免疫小鼠后都可以诱导小鼠脾细胞产生Th1型细胞因子。在RNA和蛋白水平,Th1型细胞因子IFN—γ、IL-2和IL—12的水平都明显升高,与对照组比较具有统计学差异,而三个免疫组之间没有差异。三种免疫原对Th2型细胞因子的产生没有影响。
(3)通过环磷酰胺和氢化可的松免疫抑制成功建立了系统性白色念珠菌感染兔模型,检测结果证明,在感染过程中Sap2抗体的产生要早于Hsp90抗体。
(4)在检测的141例癌症患者血清中分别有46、44、52、48例血清对Sap2重组蛋白、展示Sap2 VKYTS表位的杂合噬菌体、Hsp90重组蛋白、展示Hsp90 C表位的杂合噬菌体阳性。经过分析证明,虽然重组蛋白的检出率略高于杂合噬菌体,但没有统计学差异,二者联合使用可以提高检出率。
因此,噬菌体展示的抗原表位能够诱导产生特异性抗体。作为一种新型的生物载体,噬菌体与化学合成载体和重组蛋白具有类似的作用,能够诱导Th1型细胞因子的产生。在白色念珠菌感染检测中,与重组蛋白具有相似的检出率。而其制备简单、省时省力的优点使噬菌体在疫苗研究和检测试剂开发中具有广阔的前景。